Aktivace kaspáz spojená s potlačením aktivity transkripčního faktoru NF-kappaB vede k monocytární diferenciaci buněk HL-60.

Na rozvoji nádorového onemocnění se kromě genových aberací nádorových buněk podílí také proces zánětu v okolních tkáních. Mezi hlavní aktivátory zánětlivého procesu patří transkripční faktor NF-kappaB, neboť aktivuje transkripci prozánětlivých působků jako jsou cytokiny, chemokiny, interleukiny nebo faktory komplementu. Negativní role NF-kappaB v tumorigenezi je také akcentována tím, že podporuje angiogenezi, proliferaci a metastázování (Poser a Bosserhoff 2004). Jedním z hlavních aktivátorů NF-kappaB v zánětlivém prostředí je cytokin TNF-alfa. V předchozích studiích jsme zjistili, že aktivaci NF-kappaB vlivem TNF-alfa je možné potlačit pomocí látek, které jsou obecně využívány jako inhibitory 5-lipoxygenázy (5-LOX). Výsledkem této interakce je změna cytokinetiky modelových buněk HL-60, zejména podpora procesu apoptózy a monocytární diferenciace (Štika et al., 2005). Použití inhibitorů 5-LOX je tedy v souladu se současným trendem „multi-targeted“ terapie nádorového onemocnění, neboť nejen že snižují produkci prozánětlivých leukotrienů, potlačují zánět prostřednictvím suprese NF-kappaB, ale také potencují procesy, které působí protinádorově. Cílem této práce bylo studium signálních drah které vedou k iniciaci těchto procesů.
Buněčným modelem této studie byla myeloidní linie HL-60 derivovaná z buněk akutní promyelocytární leukémie, která byla kultivována v RPMI 1640 médiu se sníženým obsahem séra (5%). Buňky byly předem ovlivněny vybraným inhibitorem 5-LOX MK-886 m(10 M) a po jedné hodině inkubace byl k této suspenzi přidán TNF-alfa (1 ng/ml). V případě použití inhibitorů signálních drah byly tyto podávány 1 hodinu před MK-886. Úroveň exprese studovaných proteinů byla stanovena denzitometrickou kvantifikací Western blotů. Ke studiu aktivace těchto drah jsme využili fosfospecifické protilátky, neboť k aktivaci těchto kináz dochází pomocí fosforylační modifikace. Monocytární diferenciace byla stanovena pomocí povrchových diferenciačních markerů CD11b a CD14 s využitím průtokové cytometrie (Immunotech). Funkčním důkazem monocytárního fenotypu diferencovaných buněk byla produkce kyslíkových radikálů (ROS) po stimulaci buněk opsonizovaným zymosanem (OZP) nebo forbol-12-myristát-13-acetátem (PMA), která byla detekována pomocí chemiluminiscenčního substrátu luminolu. Přítomnost buněk zaniklých apoptotickou formou buněčné smrti byla hodnocena morfologicky (barvení DAPI), průtokovou cytometrií (Anexin V Apronex) nebo pomocí detekce štěpení kaspázových substrátů a pro-kaspáz Western blottingem (protilátky Santa Cruz Biotechnol.) nebo kaspázovou esejí s využitím substrátu fluoreskujícího po rozštěpení kaspázou (Alexis).
Nejprve byla studována aktivace drah mitogenem aktivovaných protein kináz (MAPK), které leží v signální dráze TNF-alfa. Pro-apoptotické dráhy p38 a JNK (Ahn et al. 2005, Su et al. 2005) jsou aktivovány již 15 minut po přidání látek. Tato aktivace je však transientní na rozdíl od dráhy ERK podporující přežití buněk (Nyunoya et al. 2005), která je aktivována pomaleji, ale se vzrůstající tendencí. Po třech dnech inkubace jsou mírně aktivovány pouze dráhy pro-apoptotické (p38 a JNK).
Jak již bylo zmíněno, tak fenotypovým projevem potlačení TNF-alfa indukované aktivace NFkappaB prostřednictvím inhibitorů 5-LOX je monocytární diferenciace. Tento cytokinetický parametr byl použit jako „end point“ pro testování zapojení jednotlivých signálních drah pomocí jejich inhibitorů. Vzhledem k tomu, že vlivem kombinace MK-886 + TNF-alfa dochází k aktivaci všech tří MAPK, testovali jsme jejich zapojení do procesu monocytární diferenciace pomocí běžně používaných farmakologických inhibitorů (SB202190 - p38 inhibitor, SP600125 - JNK inhibitor, U0126 - ERK inhibitor). Inhibice proapoptotických drah p38 a JNK kináz vedla k potlačení monocytární diferenciace indukované působením MK-886 + TNF-alfa. Naopak inhibitor dráhy ERK potencoval diferenciační efekt této kombinace látek. Tyto experimenty prokázaly důležitost drah p38 a JNK pro stimulaci monocytární diferenciace a negativní efekt dráhy ERK. Studován byl také vliv inhibitorů MAPK na aktivitu NF-kappaB. Přestože výsledky nebyly statisticky signifikantní, ERK inhibice vedla k mírné aktivaci NF-kappaB v krátkých inkubačních periodách a naopak inhibice p38 a JNK k inhibici NFkappaB aktivity.
Cílem další sady experimentů bylo zjistit, zdali je právě snížení aktivity NF-kappaB vlivem MK-886 tím efektem, který indukuje monocytární diferenciaci. Účinek MK-886 byl napodoben pomocí inhibitoru sc3060(SN50) (Santa Cruz), který se váže na NLS (nuclear location sequence) aktivního dimeru NF-kappaB, a tak zabraňuje jeho translokaci do jádra. Při srovnatelné míře potlačení aktivace NF-kappaB jakou navozuje MK-886 inhibitor sc3060 podporoval monocytární diferenciaci stejně jako MK-886. Z těchto experimentů plyne, že snížení aktivity NF-kappaB je jedním z důležitých kroků vedoucích k indukci diferenciace. Pozorován byl také vliv inhibitoru transaktivace NF-kappaB na aktivitu MAPK. Překvapivě došlo stejně jako u MK-886 k potenciaci aktivace pro-apoptotických kináz spuštěné pomocí TNF-alfa.
Ve studiu efektů MK-886 jsme se dále zaměřili na jeho pro-apoptotickou funkci. MK-886 je totiž ionoforem, který ve vyšších koncentracích vede k mitochondriálnímu uncouplingu a snížení mitochondriálního membránového potenciálu. Takto může být aktivována mitochondriální dráha apoptózy vedoucí přes iniciační caspázu 9. V našem modelu jsme prokázali zvýšenou aktivitu kaspáz 3, 8, 9 už 6 hodin po přidání účinných látek, což vede po třech dnech inkubace k apoptóze asi 30% buněk (kaspáza 8 je aktivována prostřednictvím TNF-alfa). Předpůsobení pan-kaspázovým inhibitorem zVAD-fmk (Alexis corp.) vedlo k snížení nejen počtu apoptotických buněk, ale především také buněk monocytárního fenotypu.
Z výše uvedených výsledků tedy plyne, že pro monocytární diferenciaci je zásadní aktivace kaspáz a apoptotického procesu, stejně jako aktivace regulačních drah podporujících proces apoptózy (kinázy p38 a JNK). Dráhy podporující přežití jsou naopak potlačovány (ERK kináza, NF-kappaB aktivita).

Literatura

1. Ahn et al. (2005) Cancer Res, 65(11):4896-901.
2. Nyunoya et al. (2005) J Biol Chem., 280(28):26295-302.
3. Poser I a Bosserhoff AK. (2004) Histol Histopathol. 19(1):173-88.
4. Su et al. (2005), Carcinogenesis, 26(1):1-10.
5. Štika et al. (2005), 237(2):263-71.

Tento projekt byl podporován granty č. 524/06/P345 agentury GAČR a výzkumnými záměry AVOZ50040507 a AVOZ50040702.