Identifikace individuálních autologních klonů myelom-reaktivních T lymfocytů.

Mnohočetný myelom (MM) je zhoubné onemocnění způsobené maligní transformací a proliferací B-lymfocytů a akumulací terminálních vývojových stadií – plazmocytů (Barlogie 2004). Vysokodávkovaná chemoterapie s podporou autologního štěpu krvetvorné tkáně je dnes považována za optimální léčebný postup u nemocných s mnohočetným myelomem. I přes dosažení kompletní léčebné odpovědi v některých případech se nedaří odvrátit relaps onemocnění. Významnou úlohu při prodloužení remise myelomu po autologní transplantaci hrají myelom-reaktivní T lymfocyty. Proto se jako nadějné jeví využití myelom-reaktivních T lymfocytů jako adoptivní buněčné imunoterapie při autologní transplantaci štěpu kostní dřeně.
T-buněčné klony mohou být charakterizovány pomocí rozdílů ve struktuře variabilní oblasti 3 určující komplementaritu (CDR3) beta řetězce (Davis 1988, Chothia 1988) a zodpovědné za rozeznání komplexů peptid-MHC. Analýza TCR repertoáru T lymfocytární odpovědi poskytuje informaci o spektru rozeznávaných antigenů. Ukazuje, zda lymfocytární odpověď je vyvolána jen několika imunodominantními antigeny nebo širokou paletou nádorových antigenů. V případě imunitní odpovědi proti danému nádorovému antigenu zprostředkované T lymfocyty s omezenou sadou TCRV genů se objevuje možnost monitorování imunoterapeutického účinku či expanze nádorově specifických T lymfocytů (O’Keefe 2004)
Silný imunogenní potenciál byl popsán u dendritických buněk (DB) naložených apoptickými tělísky nádorových buněk (Goddard 2001, Kokhaei 2004). Touto metodou mohou být identifikovány a expandovány potenciální cytotoxické myelom-specifické T lymfocyty. Aktivované lymfocyty produkující interferon gama jsou vytříděny pomocí imunomagnetických kuliček a je z nich extrahována mRNA kódující přítomné TCRB charakterizující individuální T lymfocyty. Po izolaci mRNA je provedena ukotvující reverzní transkripce modifikovanou verzí SMART metody. Variabilní a hypervariabilní oblast TCRBVDJ je amplifikována pomocí primeru specifického ke konstantní oblasti TCR a primeru pro ukotvující oligonukleotid. Po klonovaní PCR produktu do plazmidového vektoru a transformaci baktérií jsou zjišťovány jedinečné sekvence jednotlivých klonotypů. Nejvíce dominantní klonotypy jsou zastoupeny nejčastěji, takže frekvence jednotlivých TCRBVDJ sekvencí v bakterialních klonech po transformaci odpovídají frekvencím v původní populaci magneticky separovaných T lymfocytů.
Tato metoda nevyžaduje předchozí znalost specifických epitopů nebo MHC vázaných elementů. Protože každý T lymfocyt obsahuje jeden produktivně přeskupený TCRBVDJ lokus s určitou sekvencí, počet detekovaných kopií genu přímo odpovídá počtu klonů přítomných ve vzorku a může sloužit ke kvantitativnímu sledování průběhu onemocnění a k monitorování individuálních nádorově-specifických T lymfocytů v klinických studiích. Postup identifikace a charakterizace myelom-specifických klonů tak představuje novou metodu imunologického sledování účinnosti protinádorové léčby. (Michálek 2003, Plasilova 2003).

Literatura

1. Barlogie B., Shaughnessy J., Trikot G. a kol. Treatment of multiple myeloma. Blood. 2004; 1: 20-32
   
2. Chothia C., Boswell D. R., Lesk A. M. The outline structure of the T-cell alpha beta receptor. EMBO J. 1988. 7(12):3745-55
   
3. Davis M. M., Bjorkman P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 1988. 334(6181):395-402
   
4. Goddard R. V., Prentice A. G., Copplestone J. A. a kol. Generation in vitro of B-cell chronic lymphocytic leukaemia-proliferative and specific HLA class-II-restricted cytotoxic T-cell responses using autologous dendritic cells pulsed with tumour cell lysate. Clin Exp Immunol. 2001. 126(1):16-28
   
5. Kokhaei P., Choudhury A., Mahdian R. a kol. Apoptotic tumor cells are superior to tumor cell lysate, and tumor cell RNA in induction of autologous T cell response in B-CLL. Leukemia. 2004. 18(11):1810-5
   
6. Michálek J., Collins R. H., Hill B. J. a kol. Identification and monitoring of graft-versus-host specific T-cell clone in stem cell transplantation. Lancet. 2003. 361(9364): 1183-5
   
7. O’Keefe C. L., Plasilova M., Wlodarski M. a kol. Molecular analysis of TCR clonotypes in LGL: a clonal model for polyclonal responses. J Immunol. 2004. 172(3): 1960-9
   
8. Plasilova, M., Risitano A., Maciejewski J. P. Application of the molecular analysis of the T cell receptor repertoire in the study of immune-mediated hematologic disease. Hematol. J. 2003. 8:173

Tato studie byla podporována grantem IGA MZČR 1A/8709-5.