Molekulárně genetická analýza polymorfismů a STR lokusů u pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic

Úvod

V naší pilotní studii jsme zvolili dva přístupy zaměřené jednak na predispoziční faktory na úrovni zárodečné DNA, jednak na změny v DNA nádorových buněk u pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic (NSCLC). Prvním přístupem byla genotypizace čtyř jednonukleotidových polymorfismů (SNP) umístěných na dlouhém raménku 15.chromozomu blízko genů pro podjednotky nikotinového acetylcholinového receptoru (nAChR), které byly nedávno popsány jako asociované s plicní rakovinou. Druhou oblastí našeho zájmu je analýza genomové nestability (ztráty heterozygozity - LOH) krátkých tandemových repetic (STR) v blízkosti čtyř tumor supresorických genů (APC, VHL, FHIT a TP53), jejichž mutace jsou často popisovány v buňkách plicní rakoviny. Uvedené STR jsme vyšetřovali ve volné DNA (cell free DNA, cfDNA) izolované z plasmy pacientů s plicní rakovinou.

Materiál a metody

Vzorky

Vzorky genomické DNA byly izolovány ze suspenze jaderných buněk krve získané od 64 pacientů s diagnózou NSCLC (skupina NSCLC) a od 81 pacientů s jiným plicním nenádorovým onemocněním (skupina KOP). Kontrolní skupinu (skupina KOA) tvořilo 89 anonymizovaných DNA izolovaných ze zbytkových periferních krví rutinní hematologické laboratoře.

Vzorky plasmatické cfDNA byly izolovány od 47 pacientů s diagnózou NSCLC (skupina NSCLC) a od 70 pacientů s jiným plicním nenádorovým onemocněním (skupina KOP). Kontrolní skupinu (skupina KOA) tvořilo 28 anonymizovaných cfDNA izolovaných z plasmy zbytkových periferních krví rutinní hematologické laboratoře.

Oba typy DNA vzorků jsme izolovali pomocí kolony QIAGEN podle příslušných firemních protokolů (QIAamp DNA Minikit firmy QIAGEN) z 800 l plasmy, resp. z 25 l buněčné supenze.

SNP analýza

Polymorfismy rs16969968, rs931794, rs1051730, rs8034191 v genomické DNA byly analyzovány pomocí kitu SNaPshot Multiplex kit (Applied Biosystems) podle standardního firemního protokolu. Podstatou této metody je sekvenace jedné báze u všech polymorfismů současně na základě vmezeřování dideoxynukleotidů. Produkty sekvence jsou různě dlouhé a byly detekovány pomocí kapilární elektroforézy na analyzátoru PERKIN ELMER ABI Prism 310 Genetic Analyser dle standardních provozních protokolů (obrázek 1).



STR analýza

Kvantifikace cena

Koncentraci DNA v izolátech z plasmy a z jaderných buněk jsme měřili s použitím Real Time PCR pomocí analyzátoru ABI PRISM 7 000 (Applied Biosystems). Signál odpovídající amplifikaci zkoumaného roztoku DNA se porovnává se standardní křivkou DNA o známé koncentraci. Výsledná koncentrace zkoumaného roztoku DNA se vyjadřuje v počtu genomových ekvivalentů (GE) v 1ml plasmy. Pro detekci celkového obsahu cell free DNA v roztoku byla použita sekvence housekeepingového genu pro glyceraldehyd-3-fostát dehydrogenázu (GAPDH). Pro zajištění reprodukovatelnosti následné STR analýzy byly použity vzorky, jejichž koncentrace byla vyšší než 90 GE.

Time release PCR (TR PCR)

Jedná se o PCR, kdy se postupně snižuje teplota anealingu. Počáteční vysoká teplota anealingu má za následek zvýšení specifity nasedání primeru; postupné snižování teploty a větší množství cyklů (50-60) zvyšuje výnosnost reakce.

Použité primery, které ohraničovaly STR úseky, byly TPP53 di, D5S346, D5S318, D5S299, D3S1560, D3S1300, D5S82. Před samotnou reakcí jsme nechali zaktivovat AmpliTaqGold polymerázu (Applied Biosystems) 1 min. při teplotě 95°C. Dále pak reakce probíhala takto: denaturační teplota byla 94°C, teplota anaelingu klesala od 61°C do 57°C po 1 stupni na cyklus a teplota extenze byla 72°C.

Analýza fenotypu MSI/LOH

Mikrosatelity neboli STR jsou repetitivní úseky DNA nacházející se v průběhu celého genomu. Mikrosatelitová instabilita (MSI) je potvrzena, jestliže se délka repetitivních úseků DNA liší v tumoru a ve zdravé tkáni. Jedná se o důsledek poruchy genů chránících integritu genomu, a tedy neschopnosti opravit chybnou replikaci genomu v nádorové buňce. Nejčastějším projevem MSI je tzv. ztráta heterozygozity (LOH, loss of heterozygosity)

Výsledky

SNPanalýza

Vyšetřované polymorfismy (rs16969968, rs931794, rs1051730, rs8034191) mapovaly do segmentu dlouhého 88 kbp. Rozložení genotypů pro sledovanou a obě kontrolní skupiny pro polymorfismus rs8034191 znázorňuje Graf 1, pro ostatní polymorfismy jsou nálezy podobné. V našem souboru jsme detekovali nižší frekvenci homozygotů pro jednotlivé SNP alely než uvádí databáze HapMap. Nejnižší frekvence SNP alel jsme detekovali u nádorových pacientů na rozdíl od ostatních skupin (Graf 2). Jakkoli jsou genotypová rozložení mezi jednotlivými skupinami rozdílná, rozdíly mezi alelickými frekvencemi pro nádorovou a kontrolní skupiny nejsou statisticky signifikantní.

STR analýza

Kvantifikací cfDNA v plasmě všech vyšetřovaných osob jsme zjistili, že tato hladina je zvýšená jak v plasmě pacientů s nádorovým onemocnění tak i u pacientů s jinými plicními onemocněním. Nejvyšší rozptyl jednotlivých koncentrací jsme detekovali u pacientů s nádorem (Graf 3).

Dále jsme analyzovali genomovou nestabilitu pomocí detekce LOH v STR úsecích. U 66% pacientů s nádorem byla detekována žádná či alespoň jedna LOH, podobný výsledek jsme ale nalezli i u obou kontrolních skupin (60% KOP, 75% KOA respektive). Dva a více LOH u jednoho pacienta byly častěji pozorovány u pacientů s nádorovým (34%) a u kontrol s jiným plicním onemocněním (27%) na rozdíl od skupiny anonymizovaných osob (11%) (Graf 4). Nejvyšší počet LOH na jednoho pacienta byl pozorován jen ve skupině pacientů s nádorem (5 LOH na pacienta ze sedmi vyšetřovaných STR), v této skupině jsme také detekovali tzv. úplnou LOH, kdy jedna z alel kompletně vymizí, a MSI (rozpad signálu jedné z alel) v okolí genu TP53. Tuto MSI jsme detekovali i u jednoho pacienta s jiným plicním onemocněním.

Diskuse

Nedávné celogenomové asociační studie (GWAS, genome-wide association studies) (Amos et al. 2008, Thorgeirsson et al. 2008) objevily, že oblast 15q25.1 se zdá být asociovaná s plicními nádory. Tyto studie vytipovaly na větších populačních vzorcích (původem z Islandu, Skandinávie, západní Evropy a USA) několik polymorfismů, které by mohly být predispoziční k tomuto onemocnění. V naší laboratoři jsme testování těchto polymorfismů nedávno zavedli a použili na soubor našich pacientů a kontrol s cílem, zda v české populaci také objevíme určitou asociaci s nádorovým onemocněním. V naší pilotní studii jsme zjistili, že náš soubor českých pacientů má nižší frekvenci homozygotů pro SNP alelu než je uváděno v databázi HapMap pro evropskou populaci. Dále jsme nedetekovali žádnou závislost mezi frekvencí konkrétní alely a diagnózou pacienta. Náš výsledek je možné vysvětlit daleko menším souborem osob vyšetřovaných v pilotní studii než je uváděno v celogenomových asociačních studiích. Dále jsme detekovali statisticky signifikantní rozdíl v rozložení genotypů mezi skupinou pacientů s NSCLC a kontrolní skupinou anonymizovaných osob u SNP markeru rs8034191 (P = 0,00094261) a rs1051730 (P = 0,005237). Zdá se, že v naší populaci je rizikovější ancerstrální alela.

Druhým přístupem byla analýza volné plasmatické DNA (cfDNA) pacientů s NSCLC, která se řadí po bok metodám využívajícím k molekulárně genetickým testům DNA izolovanou ze sputa, z kondenzátu vydechovaného vzduchu či z cirkulujících nádorových buněk; již delší dobu je diskutováno její využívání pro zkvalitnění diferenciální diagnostiky plicních tumorů. Nejprve jsme provedli její kvantifikaci. Z našeho nálezu vyplývá, že pacienti s plicní rakovinou mají mírně zvýšenou hladinu cfDNA v plasmě a také nejvyšší rozptyl hodnot této koncentrace na rozdíl od obou kontrolních skupin. Obecně se však nezdá být pouhé měření této koncentrace významným pomocníkem při diferenciálně diagnostické rozvaze nad pacientem.

Po kvantifikaci cfDNA následovala LOH analýza STR úseků v okolí genů APC, VHL, FHIT a TP53, které jsou spojovány s vývojem plicní rakoviny. Pro jednotlivé tyto oblasti jsme srovnávali genomovou stabilitu cfDNA s nálezy v DNA izolované z jaderných buněk periferní krve téhož jedince, a to napříč všemi skupinami. Zjistili jsme, že kumulativní nález dvou a více LOH je charakteristický spíše pro skupinu nádorových pacientů. Častý nález jedné LOH v kontrolní skupině pacientů s jiným plicním onemocněním není zas tak překvapující, protože nálezy LOH byly popsány i u benigních (především zánětlivých) plicních onemocnění, kdy dochází k akumulaci a degradaci normálních buněk. U anonymizovaných vzorků (skupina KOA) je tento nález možné vysvětlit tím, že nás jednak omezovala hraniční koncentrace 90 GE (zdraví jedinci mají většinou velmi malou koncentraci cfDNA v plasmě a nelze je proto testovat opakovaně, případně vůbec), a za druhé tyto vzorky pocházejí z rutinní hematologické laboratoře, a proto se domníváme, že nejde o zcela a nikoli vždy (pomineme-li skrínink u gravidních žen) zdravé jedince. MSI a LOH jsou totiž popisovány i u jiných nenádorových onemocnění jako je astma, autoimunita, ateroskleróza aj.

Na souboru pacientů s NSCLC (zatím omezeného rozsahu) jsme nenalezli žádnou signifikantní spojitost mezi MSI/LOH analýzou cfDNA v plasmě a individuálním genotypem (alelami) čtyř SNP v oblasti 15q25.1.

Závěrem můžeme konstatovat, že STR analýza nám zároveň posloužila k průkazu (větší či menší) příměsi nádorové DNA v celkové plasmatické cfDNA. Příštím pokračováním výzkumu na cfDNA tak může být pátrání po specifických mutacích v přepisovaných (exonických) oblastech kandidátních genů plicní kancerogeneze.

Literatura

1. Amos, C.I. et al. (2008) Genome-wide association scan of tag SNPs identifies a susceptibility locus for lung cancer at 15q25.1. Nat. Genet., 40,616–622
   
2. Andriani, F., Conte, D., Mastrangelo, T., Leon, M., Ratcliffe, C., Roz, L., Pelosi, G., Goldstraw, P., Sozzi, G. and Pastorino, U. (2004). Detecting lung cancer in plasma with the use of multiple genetic markers. Int J Cancer 108:91-96.
   
3. Beau-Faller, M., Gaub, M. P., Schneider, A., Ducrocq, X., Massard, G., Gasser, B., Chenard, M. P., Kessler, R., Anker, P., Stroun, M., Weitzenblum, E., Pauli, G., Wihlm, J. M., Quoix, E. and Oudet, P. (2003). Plasma DNA microsatellite panel as sensitive and tumor-specific marker in lung cancer patients. Int J Cancer 105:361 -370.
   
4. Sozzi, G. et al. (2003). Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J ClinOncol 21, 3902 - 3908.
   
5. Thorgeirsson, T.E. et al (2008) Avariant associated with nicotine dependence, lung cancer and peripheral arterial disease. Nature, 452, 638 – 642
   
6. Xue, X., Zhu, Y. M. and Woll, P. J. (2006). Circulating DNA and lung cancer. Ann NY Acad Sci 1075:154 - 164.