Molekulární diagnostika, follow-up a stanovení minimální residuální nemoci u pacientů s non-hodgkinovskými lymfomy

V Laboratoři molekulární patologie se zabýváme diagnostikou a sledováním průběhu onemocnění na molekulární úrovni u pacientů s non-Hodgkinovskými lymfomy (NHL) z B a T buněk. Genetické změny jsou zodpovědné za patogenezi i prognosu nádorových onemocnění. V moderní biomedicíně se stává propojení mezi histomorfologií a patofyziologií na molekulární úrovni důležitým nástrojem pochopení vývoje onemocnění, určení diagnostických markerů i potencionálních terapeutických cílů. Molekulární analýza nádorové tkáně poskytuje účinný nástroj detekce vzorků s minimálním obsahem buněk, napomáhá diferenciální diagnostice, umožňuje záchyt minimální reziduální nemoci, stanovení diagnostických, prognostických markerů i potencionálních terapeutických cílů. Molekulární vyšetření je v současnosti nedílnou součástí spektra diagnostických možností patologie a je významným přínosem v situaci nejasné diagnostiky. Rovněž se molekulární diagnostika využívá při stanovení nízkého stupně infiltrace kostní dřeně/periferní krve a pro follow-up pacientů, kde ostatní metody nejsou dostatečně citlivé. Výhodou molekulární analýzy je citlivost, specifita, reprodukovatelnost a objektivní hodnocení výsledků.

U pacientů s NHL vyšetřujeme klonalitu onemocnění, kdy využíváme mezinárodní protokol (European BIOMED-2 collaborative study) (lit: Leukemia 2003;17:2257-2317) pro detekci přestaveb genů pro imunoglobuliny a T buněčné receptory pomocí „multiplex“ polymerázové řetězové reakce (PCR). U imunoglobulinových genů vyšetřujeme přeskupení těžkých (IgH), lehkých lamda (IgL) a kappa (IgK) řetězců, v případě T buněčných receptorů (TCR) řetězce delta (TCRD), gama (TCRG) a beta (TCRB). Na základě detekované klonální přestavby v primárním nádoru následně provádíme sledování minimální residuální nemoci (MRN) v kostní dřeni a periferní krvi pomocí pacient specifických primerů a kvantitativní PCR v reálném čase.

U pacientů s folikulárním lymfomem (FL) vyšetřujeme přítomnost translokace t(14;18). FL jsou diagnostikovány na základě histologického obrazu a imunohistochemického profilu (CD20+ a ve většině případů BCL2+, CD10+ a BCL6+). U většiny nemocných s FL (80-90%) je nádor charakterizován translokací t(14;18)(q32;q21). Průkaz translokace na molekulární úrovni lze využít jak pro upřesnění diagnózy, tak pro následné monitorování pacientů - infiltrace kostní dřeně a periferní krve. U pacientů s FL sledujeme MRN pomocí kvantitativní PCR v reálném čase.

U pacientů s „mucosa associated lymphoid tissue“ (MALT) lymfomy vyšetřujeme přítomnost translokace t(11;18). MALT lymfomy jsou lymfomy nízkého stupně malignity charakterizované imunofenotypem CD20+, CD10-, CD5-, cyclin D1-). V důsledku translokace t(11;18) vzniká fúzní gen MALT/API, který zahrnuje gen pro apoptotický inhibitor API2 a gen MALT. Translokace je specifická pro 40% gastrických a plicních MALT lymfomů. U pacientů nesoucích popsanou translokaci je známé snížené riziko transformace do lymfomu vyššího stupně malignity. Molekulární detekce fúzního genu MALT/API upřesňuje diferenciální diagnosu a umožňuje molekulární sledování MRN pomocí kvantitativní PCR v reálném čase.

U pacientů s anaplastickým velkobuněčným lymfomem (ALCL) sledujeme expresi fúzního genu NPM/ALK, molekuly CD30 a klonálních přestaveb TCR. ALCL je skupina NHL vznikajících transformací lymfoidních elementů T řady, diagnostikovaných na základě morfologického obrazu a imunohistochemického profilu (ALK-1 protein+, CD30+, markery B a T řady, granzym B+, perforin+, TIA-1+). U ALK+ ALCL dochází k patologické aktivaci onkogenu v důsledku translokace s různými translokačními partnery. Aktivovaný onkogen ALK stanovujeme ve fúzi s různými partnery: ALK/NPM, ALK/TPM3, ALK/TGF, ALK/ATIC, ALK/CTLC. Uvedená molekulární vyšetření napomáhají diferenciální diagnose a umožňují sledovat MRN. Pomocí kvantitativní PCR v reálném čase můžeme kvantifikovat množství nádorových buněk infiltrujících kostní dřeň, příp. periferní krev pomocí detekce exprese fúzního genu NPM/ALK, molekuly CD30 a klonálních přestaveb TCR.

U pacientů s lymfomem z buněk pláště (MCL) provádíme kvantitativní detekci exprese cyklinu D1 a proliferačních markerů Ki-67, topoisomerasy II alfa a TPX2. MCL je onemocnění vznikající transformací naivních B lymfocytů pláště folikulů lymfatických uzlin, vyznačující se nepříznivou prognosou, agresivním klinickým průběhem a resistencí ke konvenční terapii B-NHL. Diferenciální diagnosa se opírá o typickou morfologii a imunofenotyp (CD19+, CD20+, CD79a+, Ig+, CD5+, CD43+, CD10-, BCL6-, CD23-). U MCL dochází k transkripční deregulaci genu CCND1 vedoucí k patologické expresi cyklinu D1 vlivem translokace t(11;14). Exprese cyklinu D1 nebo detekce t(11;14) je podle současných WHO kriterií nezbytnou součástí diferenciální diagnosy MCL. Sledování hladiny exprese cyklinu D1 představuje spolehlivý nástroj diferenciální diagnostiky lymfomů a má význam pro molekulární detekci choroby v kostní dřeni, případně periferní krvi. Navíc sledování úbytku případně nárůstu hladiny cyklinu D1 je vhodné pro sledování dynamiky onemocnění. Up-regulace genů, které jsou asociovány s proliferační aktivitou buněk je hlavním prognostickým faktorem pro pacienty s MCL. Proliferace má přímý dopad na určení charakteru onemocnění MCL a napomáhá stratifikaci pacientů z hlediska individuální prognosy onemocnění před zahájením léčby. Kvantitativní PCR představuje přesný přístup objektivního hodnocení proliferační aktivity nádorů na kvantitativní úrovni.

Laboratoř molekulární patologie představuje komplexní přístup specializovaných molekulárních vyšetření non-Hodgkinovských lymfomů. Kombinace řady molekulárních vyšetření zpřesňuje diferenciální diagnostiku lymfomů a umožňuje sledovat pacienty na molekulární úrovni. Využití moderní technologie kvantitativní PCR v reálném čase umožňuje kontrolovat dynamiku onemocnění (včetně dynamiky hladiny infiltrace kostní dřeně a periferní krve) během léčby pacientů. Můžeme tak individuálně u každého pacienta monitorovat dynamiku rozvoje onemocnění, reakci na terapii, případně progresi nemoci. Včasná detekce nárůstu nádorové populace umožní včasnější léčebnou reakci.

Projekt je podporován grantem IG FNM 9756, GAUK 200055, 46/2006/C/2.LF a výzkumným záměrem MZO ČR 00064203/6704 a MŠMT ČR 0021620813.