Konference: 2006 2. ročník Dny diagnostické, prediktivní a experimentální onkologie
Kategorie: Onkologická diagnostika
Téma: Chyby a omyly v diagnostice nádorových onemocnění
Číslo abstraktu: 022
Autoři: MUDr. Petra Kleiblová, Ph.D.; J. Ševčík; E. Scholzová
Kvantitativní RT-PCR v reálném čase (qPCR) je
často používanou metodou umožňující rychlou a relativně jednoduchou
kvantifikaci genové exprese na úrovni syntézy mRNA. Nespornou
výhodou této metody je její vysoká specifita i senzitivita a
dynamický rozsah kvantifikace v rozmezí několika řádů. Všechna
uvedená pozitiva jsou však podmíněna vysokou kvalitou templátové
RNA (mRNA), účinnou reverzní transkripcí a technicky bezchybným
provedením vlastní qPCR, jak je diskutováno v mnoha odborných
publikacích. Přesto, pouhé dodržení kvality jednotlivých kroků qPCR
nezaručuje, získání nezkresleného obrazu expresního profilu
sledované buněčné populace.
Standardní součástí qPCR by mělo být též mnohdy opomíjené stanovení efektivity amplifikace každého amplikonu za optimalizovaných podmínek (minimálně anelační teplotě a koncentraci Mg2+). Snahou veškerých optimalizací je pochopitelně připravit pokus s co nejjednodušším vyšetřovacím algoritmem (tzn. co nejmenší počet anelačních teplot, při kterých jsou vyšetření prováděna) a s co nejshodnějšími qPCR efektivitami. Obvyklou metodou je zhotovení kalibrační křivky a z ní následné určení efektivity qPCR.
U qPCR existují dva nejčastější přístupy k vyhodnocování míry exprese sledovaných genů:
Závěr: Pro vyhodnocení exprese sledovaných genů pomocí qPCR je nezbytné nejen správné provedení vlastní qPCR za optimalizovaných reakčních podmínek, ale i následná kvalitní matematická a statistická analýza získaných dat, zvláště pak v případech, kdy qPCR není prováděna na základě validovaných postupů. Pouze na základě tohoto přístupu možné získat údaje o míře genové exprese odpovídající skutečnému stavu ve vyšetřovaném materiálu.
Podpořeno grantovým projektem IGA MZ ČR 1A/8708-4
Standardní součástí qPCR by mělo být též mnohdy opomíjené stanovení efektivity amplifikace každého amplikonu za optimalizovaných podmínek (minimálně anelační teplotě a koncentraci Mg2+). Snahou veškerých optimalizací je pochopitelně připravit pokus s co nejjednodušším vyšetřovacím algoritmem (tzn. co nejmenší počet anelačních teplot, při kterých jsou vyšetření prováděna) a s co nejshodnějšími qPCR efektivitami. Obvyklou metodou je zhotovení kalibrační křivky a z ní následné určení efektivity qPCR.
U qPCR existují dva nejčastější přístupy k vyhodnocování míry exprese sledovaných genů:
- A. Metodou absolutní kvantifikace je stanovován konkrétní počet kopií mRNA na určitou jednotku (např.počet buněk použitých pro izolaci RNA).
- B. Častěji užívanou je kvantifikace relativní, při které jsou pro normalizaci množství mRNA vstupujícího do dané reakce použity takzvané housekeeping geny (HK; např.často používané geny pro ribosomální proteiny, B2M nebo GAPDH). Takové geny jsou pro určitou buněčnou populaci charakteristické tím, že míra jejich exprese je málo ovlivněna změnou stavu buňky (nebo na ni nemají vliv okolnosti, které jsou v pokusu vyšetřovány).
Závěr: Pro vyhodnocení exprese sledovaných genů pomocí qPCR je nezbytné nejen správné provedení vlastní qPCR za optimalizovaných reakčních podmínek, ale i následná kvalitní matematická a statistická analýza získaných dat, zvláště pak v případech, kdy qPCR není prováděna na základě validovaných postupů. Pouze na základě tohoto přístupu možné získat údaje o míře genové exprese odpovídající skutečnému stavu ve vyšetřovaném materiálu.
Podpořeno grantovým projektem IGA MZ ČR 1A/8708-4
Datum přednesení příspěvku: 8. 12. 2006