Chyby a omyly ve vyhodnocování kvantitativní PCR

Kvantitativní RT-PCR v reálném čase (qPCR) je často používanou metodou umožňující rychlou a relativně jednoduchou kvantifikaci genové exprese na úrovni syntézy mRNA. Nespornou výhodou této metody je její vysoká specifita i senzitivita a dynamický rozsah kvantifikace v rozmezí několika řádů. Všechna uvedená pozitiva jsou však podmíněna vysokou kvalitou templátové RNA (mRNA), účinnou reverzní transkripcí a technicky bezchybným provedením vlastní qPCR, jak je diskutováno v mnoha odborných publikacích. Přesto, pouhé dodržení kvality jednotlivých kroků qPCR nezaručuje, získání nezkresleného obrazu expresního profilu sledované buněčné populace.
Standardní součástí qPCR by mělo být též mnohdy opomíjené stanovení efektivity amplifikace každého amplikonu za optimalizovaných podmínek (minimálně anelační teplotě a koncentraci Mg2+). Snahou veškerých optimalizací je pochopitelně připravit pokus s co nejjednodušším vyšetřovacím algoritmem (tzn. co nejmenší počet anelačních teplot, při kterých jsou vyšetření prováděna) a s co nejshodnějšími qPCR efektivitami. Obvyklou metodou je zhotovení kalibrační křivky a z ní následné určení efektivity qPCR.
U qPCR existují dva nejčastější přístupy k vyhodnocování míry exprese sledovaných genů:

• A. Metodou absolutní kvantifikace je stanovován konkrétní počet kopií mRNA na určitou jednotku (např.počet buněk použitých pro izolaci RNA).
• 
  
• B. Častěji užívanou je kvantifikace relativní, při které jsou pro normalizaci množství mRNA vstupujícího do dané reakce použity takzvané housekeeping geny (HK; např.často používané geny pro ribosomální proteiny, B2M nebo GAPDH). Takové geny jsou pro určitou buněčnou populaci charakteristické tím, že míra jejich exprese je málo ovlivněna změnou stavu buňky (nebo na ni nemají vliv okolnosti, které jsou v pokusu vyšetřovány).

Relativní způsob hodnocení exprese má proti kvantifikaci absolutní výhodu v tom, že takto získané výsledky jsou výrazně méně zkresleny například nepredikovatelnými ztrátami genetického materiálu RNA. Avšak i relativní kvantifikace genové exprese má svá úskalí. Nezřídka dojde ke zkreslení výsledků jinak zcela perfektně provedeného vyšetření špatnou volbou způsobu vyhodnocení dat získaných z vyšetření na základě tzv. crossing points – CP (nazývaných též cross tresholds – CT). Velmi oblíbenou je pro svou jednoduchost metoda ΔΔCP, která je však vhodná výhradně pro PCR probíhající v exponenciální fázi amplifikace se 100% účinností (tzn.za zdvojnásobení počtu amplikonů mezi jednotlivými cykly). Přes frekventní použití je tato kvantifikační metoda bez znalosti efektivity amplifikace konkrétní PCR k vyhodnocování genové exprese relativní kvantifikací zcela nevhodná. Mnohem přesnější a korektnější přístup k posouzení míry exprese je stanovení reálné efektivity konkrétní PCR pro TG a HK, a jejich zohlednění při matematickém hodnocení míry exprese. Toto dnes již umožňují mnohé softwarové programy, které kromě vyhodnocení kalibračních křivek a relativní genové exprese na základě efektivity umožňují i statistickou validaci získaných výsledků (například: REST, GeNorm, qGENE).
Závěr: Pro vyhodnocení exprese sledovaných genů pomocí qPCR je nezbytné nejen správné provedení vlastní qPCR za optimalizovaných reakčních podmínek, ale i následná kvalitní matematická a statistická analýza získaných dat, zvláště pak v případech, kdy qPCR není prováděna na základě validovaných postupů. Pouze na základě tohoto přístupu možné získat údaje o míře genové exprese odpovídající skutečnému stavu ve vyšetřovaném materiálu.
Podpořeno grantovým projektem IGA MZ ČR 1A/8708-4