Cytogenetika a molekulární cytogenetika difúzního velkobuněčného lymfomu (DLBCL)

Difůzní velkobuněčný lymfom (DLBCL) je nejčastějším typem nehodgkinských lymfomů a tvoří asi 30% všech diagnostikovaných NHL. DLBCL může vznikat de novo, ale asi ve 40% případů je vznik DLBCL výsledkem transformace z folikulárního lymfomu (FL) nebo jiného lymfoproliferativního onemocnění. Jedná se o klinicky a biologicky velmi heterogenní onemocnění. Ačkoliv příčiny vzniku nejsou přesně známé, stejně jako u jiných nádorů, patogeneze DLBCL představuje mnohastupňový proces, který zahrnuje akumulaci řady genetických a epigenetických změn, které ve svém důsledku vedou k selekci maligního klonu.

Molekulární patogeneze DLBCL zahrnuje různé chromosomové translokace, aberantní mechanismy somatické hypermutace, genové mutace, delece i amplifikace, které se na vzniku a vývoji DLBCL podílejí (Obr.1).

Cytogenetické studie odhalily vysoké procento výskytu chromosomových změn. Translokace se vyskytují až u 50% nemocných, nebalancované chromosomové změny u 67% nemocných (Obr 1). Snaha o vysvětlení obrovské genetické heterogenity vedla vědecké týmy k aplikaci nejmodernějším metod molekulární biologie.

Expresní profilování (Alizadeh et al, 2000; Rosenwald et al, 2002) potvrdilo existenci dvou, později tři expresně rozdílných podskupin DLBCL (Staudt & Dave, 2005). Podskupina označená CGB - DLBCL se vyznačuje expresí genů charakteristických pro normální B buňky germinálních center (GC signature genes), zatím co podskupina ABC DLBCL exprimuje geny charakteristické pro in vitro aktivované periferní B lymfocyty. Třetí podskupinu (5% všech agresivních lymfomů) tvoří nemocní s primárním mediastinálním lymfomem (PMBL) s expresí genů odlišnou od obou podskupin (Obr. 2).

Odlišení těchto tří podskupin je velmi významné z hlediska prognózy nemocných. Zatím co 5leté přežití bylo určeno pro 64% nemocných s PMBL a 59% nemocných s GCB DLBCL, pro skupinu ABC DLBCL bylo pětileté přežití pozorováno pouze u 30% sledovaných nemocných. To znamená, že přesné určení prognózy a následná správná volba léčby je pro tyto nemocné významná.

Je otázkou, zda jsme schopni bez expresního profilování nemocné takto diferencovat. V roce 2005 se pokusil tým pracovníků vedený Silvií Bea (Bea et al, 2005) analyzovat 224 nemocných s DLBCL, kteří byli rozděleni do prognostických podskupin na základě expresních profilů. K analýze chromosomových nebalancovaných změn použili metodu komparativní genomové hybridizace (CGH). Tato molekulárně cytogenetická metoda dovoluje určit nebalancované změny, delece a amplifikace chromosomových oblastí s rozlišením 5-10 Mb (megabazí).

Zjistili, že expresním profilem určené podskupiny se významně od sebe liší specifickými nebalancovanými chromosomovými aberacemi (Obr.3). ABC podtyp je spojen s trisomií chromosomu 3 nebo zmnožením 3q, chromosomu 18q a delecí na chromosomu 6q21-22. Podtyp CGB má nejčastěji zmnožení genetického materiálu na dlouhých ramenech chromosomu 12q12 a PMBL má nejčastěji zmnožení genetického materiálu krátkých ramen chromosomu 9 (9p). Potvrdili, že amplifikace a zmnožení (gains) má významný vliv na expresi genů lokalizovaných v dané chromosomové oblasti. Tyto časté nebalancované změny se mohou vyskytovat až u 40% nemocných.


Na základě výsledků genetických analýz bylo navrženo rozdělení podskupin DLBCL (Obr. 4). Sledovat časté nebalancované změny prognostického významu je možné také moderní čipovou technologii, která se nazývá array komparativní genomová hybridizace (array CGH).

Array CGH je molekulárně cytogenetická metoda, která dovoluje určit nebalancované změny (delece, monosomie, duplikace, trisomie, amplifikace) analýzou celého genomu v jediném vyšetření. Je založena na společné hybridizaci rozdílně značené kontrolní a nádorové genomické DNA k hybridizačnímu sklu (microarray), na kterém jsou umístěny jednořetězcové fragmenty DNA genů, jejichž změny chceme sledovat.

Metodu array CGH s microarray K3 ( 3674 BAC klonů pokrývající celý genom, rozlišení ~1Mb, Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands) jsme použili k analýze souboru 25 nemocných s diagnózou DLBCL. Cílem studie bylo společně s cytogenetikou a metodou FISH, určit navržené prognostické podskupiny DLBCL, určit nejčastější chromosomové změny a jejich frekvenci, analyzovat genetické změny u DLBCL vzniklých transformací FL a pokusit se určit klinický význam cytogenetiky a molekulární cytogenetiky u DLBCL.


Skupina 25 vyšetřených nemocných byla histologicky diagnostikována jako DLBCL u 16 nemocných, 3 nemocní jako PMBL, 3 nemocní jako transformace FL do DLBCL , u tří nemocných nebyl typ NHL v prvním čtení přesně určen.

Celkem 13 nemocných bylo vyšetřeno z uzliny, 10 z buněk kostní dřeně, jeden nemocný z buněk získaných z výpotku a jeden z buněk periferní krve.

Molekulárně genetiky byla vyšetřena klonalita a mutační stav. Klonální populace byla nalezena u 11 nemocných, u kterých byl vyšetřen mutační stav. Mutovaný stav IgVH byl nalezen u 8 z 11 nemocných, nemutovaný u 3 nemocných. U 14 nemocných byly vyšetřeny pouze buňky kostní dřeň, ve které nebyla potvrzena klonální infiltrace dřeně nádorovými buňkami.

Klasické cytogenetické vyšetření bylo provedeno u 24 nemocných a klonální chromosomové změny byly nalezeny u 15 (62,5%) nemocných. Jednalo se jak o translokace, tak o nebalancované změny zahrnuté do komplexních změn karyotypu.

Metodou array CGH bylo vyšetřeno všech 25 nemocných. DNA pro vyšetření array CGH byla izolována standardní metodou z buněk kostní dřeně, uzliny nebo výpotku. Nebalancované změny byly nalezeny u 19 nemocných. Detailní analýza ukázala nejčastější delece na chromosomech 1p a 17p, nejčastější zmnožení genetického materiálu postihovalo chromosomy 1q, 3, 7, 9p, 12 a 18.

Aplikace kritérií pro stratifikaci nemocných do prognostických podskupin ukázala, že u našich nemocných bylo možné prognostické podskupiny na základě výsledků metodou array CGH určit u 60% nemocných (Obr. 4, 5 a 6). Výsledky vyšetření metodu fluorescenční in situ hybridizace (FISH) určily přestavbu BCL2 genu u 7 nemocných a tato translokace je kriteriem pro zařazení nemocných do prognostické podskupiny GCB. Metodou FISH byly dále odhaleny dvě vzácně se vyskytují inserce, do kterých byl zapojen onkogen CMYC. I tento nález potvrzuje velkou heterogenitu genetických změn, které se u DLBCL vyskytují.

Rozdělení nemocných do dvou podskupin, na de novo a transformované z FL neukázalo významný rozdíl ve frekvenci přídatných změn. Přídatné změny metodou array CGH byly nalezeny u 5 z 8 transformovaných DLBCL. Vzhledem ke krátkému času sledování souboru 25 nemocných s DLBCL, s mediánem sledování 48 měsíců, nelze klinický význam určení prognostických podskupina a nalezených chromosomových změn hodnotit. Z celkového počtu 25 sledovaných nemocných zemřelo 7 nemocných, z nic 5 bylo zařazeno do ABC podskupiny DLBCL, jeden nemocný byl z podskupiny GCB a jeden měl PMBL.




Cytogenetika a molekulární cytogenetika je významným nástrojem sledování genetických změn v nádorovém genomu DLBCL. Řada studií potvrzuje klinický význam chromosomových změn, avšak v naší studii jsme zatím klinický význam specifických chromosomových změn pro krátkou dobu sledování souboru nehodnotili. Získané výsledky jsou základem pro další sledování s cílem potvrdit klinický význam chromosomových změn i na našem souboru nemocných nebo odhalit nové, dosud neurčené změny.

Práce je podporována grantem MSM 6198959205 a grantem Česko-vlámské spolupráce č.1-2006-29.

Literatura:

1. Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE, et al.: Nature, 2000; 403,503-511.
   
2. Rosenwald A, Wright G, Chan WC, et al: N Engl J Med, 2002; 346, 1937-1947.
   
3. Staudt LM, Dave S: Adv. Immunol, 2005; 87:163-208.
   
4. Bea S, Zettl A, Wright G, et al: Blood, 2005; 106:3183-3190.