Detekce neobvyklé mutace nádorového supresoru p53 u Burkittova lymfomu: duplikace 30 pb

Předneseno pod názvem - Detekce neobvyklé mutace nádorového supresoru p53 u Burkittova lymfomu: inzerce 30 pb v kodónu 87

Abstrakt
Burkittovy lymfomy (BL) patří k rychle rostoucím vysoce agresivním nehodgkinským lymfomům (NHL). Charakteristickým molekulárním markerem BL je vysoká exprese protoonkogenu c-myc, která nejčastěji vyplývá z translokace t(8;14)(q24;q32), méně často z translokace t(2;8)(p12;q24) nebo t(8;22)(q24;q11). K častým genetickým změnám u BL rovněž patří aberace nádorového supresoru p53. Protein p53 je sekvenčně specifický transkripční faktor, který se váže na DNA a řídí expresi mnoha svých cílových genů jako odpověď na buněčný stres. Pro analýzu aberací p53 lze použít různé metody, například imunohistochemickou analýzu, westernový přenos, sekvenování DNA, fluorescenční in situ hybridizaci a také funkční analýzu separovaných alel v kvasinkách (FASAY). Všechny tyto metody jsme použili u prezentovaného případu BL k podrobné analýze p53. Třiapadesátiletý muž byl operován v dubnu 2006 s podezřením na difúzní velkobuněčný B-lymfom s rozsáhlým postižením dutiny břišní. Byl postižen žaludek, okolní uzliny, tkáně, kostní dřeň a CNS. Diagnóza byla uzavřena jako Burkittův lymfom, klinické stadium IVB, s pozitivitou t(8;14) detekovanou fluorescenční in situ hybridizací. Intenzivní léčbou kombinovanou imunochemoterapií bylo dosaženo kompletní remise, která trvá dosud. V buněčných jádrech nádorové tkáně pacienta jsme imunohistochemickou analýzou detekovali vysokou hladinu proteinu p53. Westernovým přenosem jsme potvrdili vysokou hladinu proteinu p53 v nádorových buňkách a zároveň jsme zjistili, že molekulová hmotnost proteinu p53 nádorových buněk je vyšší než molekulová hmotnost standardní varianty p53. Také molekulová hmotnost produktu PCR, odpovídajícího cDNA p53 z nádorové tkáně, byla vyšší než molekulová hmotnost amplifikátu standardní varianty p53. Funkční analýza v kvasinkách jednoznačně prokázala expresi nefunkční varianty p53, postrádající transkripčně aktivační schopnost, přičemž kvasinkové kolonie vykazovaly velmi neobvyklý fenotyp. Sekvenováním cDNA připravené z nádorové tkáně jsme v genu p53 detekovali duplikaci fragmentu vymezeného kodóny 77 a 87 o velikosti 30 pb (g.12155_12184dup30). Fluorescenční in situ hybridizací jsme neprokázali ztrátu heterozygotnosti p53 delecí p53 specifického lokusu 17p13.

Úvod

Burkittovy lymfomy (BL) patří k rychle rostoucím vysoce agresivním nehodgkinským lymfomům (NHL). Představují asi 1 až 2% lymfomů dospělé populace v západní Evropě a Spojených státech. Charakteristickým molekulárním markerem BL je vysoká exprese protoonkogenu c-myc, která je nejčastěji důsledkem translokace t(8;14)(q24;q32), méně často translokace t(2;8)(p12;q24) nebo t(8;22)(q24;q11). Vysoká hladina proteinu c-Myc buňkám poskytuje konstitutivní proliferační signál. c-Myc ale může také indukovat apoptózu aktivací p53 přes p14ARF. Některé práce naznačují, že právě vyřazení signální dráhy p14ARF-MDM2-p53 by mohlo představovat klíčový druhý zásah při vývoji BL. Významný podíl případů BL skutečně nese bodovou mutaci v genu kódujícím nádorový supresor p53 a jiná poškození dráhy p14ARF-MDM2-p53 (Drexler et al. 2000, Lindstrom and Wiman 2002, Wilda et al. 2004).

Nádorový supresor p53 je sekvenčně specifický transkripční faktor, který se váže na DNA a řídí expresi mnoha svých cílových genů jako odpověď na buněčný stres a podílí se na regulaci řady důležitých buněčných procesů jako jsou buněčný cyklus, apoptóza, senescence a genomová stabilita (Levine et al., 2006). Inaktivace p53 vyplývající z různých genetických aberací je jednou z nejčastějších událostí během kancerogeneze. Více než 50% všech lidských nádorů nese mutaci v genu p53. Více než 80% z nich jsou bodové záměny, tj. mutace měnící smysl kodónu, které vedou k syntéze stabilního proteinu p53 standardní velikosti (Olivier et al., 2002, Soussi et al. 2006). Pro detekci aberací p53 bylo vyvinuto několik různých metodických přístupů. (1) Ve zdravých buňkách je hladina proteinu p53 udržována degradací zprostředkovanou proteinem MDM2. Exprese genu MDM2 je regulována p53, takže MDM2 představuje zpětnovazebnou regulační smyčku (Yang et al. 2004). Nefunkční p53 nemůže indukovat expresi MDM2 a je proto stabilizován v buněčných jádrech. Vysoká hladina proteinu p53 může být detekována buď na tkáňových řezech imunohistochemickou analýzou nebo na nitrocelulózové membráně po proteinové elektroforéze a westernovém přenosu. (2) Popsáno bylo několik různých molekulárních analýz, které detekují změny v nukleotidové sekvenci geonomové DNA, mRNA nebo cDNA. Mezi nimi přímé sekvenování DNA je tou nejspolehlivější metodou detekce mutací p53. Ovšem citlivost této metody je spíše omezená, zvláště tam, kde je nádorová tkáň kontaminována nenádorovými buňkami. (3) Funkční metody mohou analyzovat některé biologické vlastnosti proteinu p53. Funkční analýza separovaných alel v kvasinkách („functional analysis of separated alleles in yeast“ - FASAY) je založena na měření transaktivačních schopností proteinu p53. Protein p53 je odvozen z nádorové tkáně pomocí RT-PCR a exprimován v transformovaných kvasinkových buňkách, které nesou reportérský gen ADE2 s předřazenou sekvencí RGC, na kterou se p53 váže (Ishioka et al. 1993, Flaman et al. 1995). Aktivita proteinu p53 se určuje jednoduše podle zbarvení kvasinkových kolonií rostoucích na selekčním médiu. Exprese funkčního p53 vede k tvorbě bílých kolonií, zatímco nefunkční, mutantní p53 způsobuje vznik červených kolonií. (4) Podle klasické hypotézy „dvou zásahů“ musí u většiny nádorových supresorů dojít k inaktivaci obou alel. Tento jev byl opakovaně prokázán také u p53 (Trkova et al. 2003). Nejčastějším, i když ne výlučným mechanismem ztráty heterozygotnosti genu p53 je ztráta p53 specifického lokusu na chromozomu 17 (17p13.1). Vhodnou metodou pro detekci této aberace je fluorescenční in situ hybridizace (FISH) s využitím p53 specifické sondy.

Využili jsme všechny výše zmíněné metody k charakterizaci neobvyklé mutace p53, kterou jsme detekovali v nádorové tkáni u pacienta s Burkittovým lymfomem. Prokázali jsme zvýšenou molekulovou hmotnost a nefunkčnost proteinu p53 u tohoto případu plynoucí z duplikace fragmentu o velikosti 30 párů bazí: g.12155_12184dup30. Duplikovaná byla část kódující sekvence vymezená kodóny 77 a 87.

Materiál a metody

Popis případu

Třiapadesátiletý muž byl operován v dubnu 2006 s podezřením na difúzní velkobuněčný B-lymfom s rozsáhlým postižením dutiny břišní. Byl postižen žaludek, okolní uzliny, tkáně, kostní dřeň a CNS. Diagnóza byla uzavřena jako klasický Burkittův lymfom, klinické stadium IVB, s translokací t(8;14) detekovanou fluorescenční in situ hybridizací. Intenzivní léčbou kombinovanou imunochemoterapií bylo dosaženo kompletní remise, která trvá dosud.

Histopatologický nález

Drobné excize obsahovaly tukovou tkáň, která byla difúzně infiltrovaná neoplastickou populací poměrně uniformních lymfoidních buněk střední velikosti. Buňky měly okrouhlá nebo polygonální jádra většinou se 2-3 zřetelnými malými jadérky při periferii, cytoplazma byla bazofilní. Buňky byly vysoce mitoticky i apoptoticky aktivní. Četné byly také makrofágy s fagocytovanými apoptotickými tělísky, místy tvořící obraz „hvězdného nebe“ (obr. 1). Součástí infiltrátu byla i příměs velmi malého množství reaktivních malých kulatých T lymfocytů (cca 1-2%). Nádorové buňky byly imunohistochemicky pozitivní na CD10, CD20, CD45, CD79a, MUM1, Bcl6 a fokálně slabě také na CD138; negativní na CD3, CD5, CD23, CD30 a Bcl-2. Proliferační aktivita dle Ki67 byla vysoká, asi 95%.

FASAY

FASAY byla provedena podle dříve popsaného postupu (Flaman et al., 1995; Smardova et al. 2001). Celková RNA byla purifikována pomocí RNeasy Mini Kit (Qiagen), cDNA syntetizována systémem SuperScript II (Invitrogen) s využitím oligo (dT)12 jako primeru. PCR byla provedena s primery P3 (5’-CCT-TGC-CGT-CCC-AAGCAA-TGG-ATG-AT-3’), P4 (5’-ACC-CTT-TTT-GGA-CTT-CAG-GTG-GCT-GGA-GT-3’) a Pfu DNA polymerázou (Stratagene). Kvasinkové buňky byly transformovány produktem PCR, linearizovaným vektorem pSS16 a nosičovou DNA (Invitrogen) s využitím octanu litného (Ishioka et al. 1993). Transformované buňky byly kultivovány na minimálním agarovém médiu bez leucinu a s nízkým obsahem adeninu (5 µg/ml). Kultivace probíhala ve 35°C po dobu 3 dnů, následně v pokojové teplotě po dobu dalších 2 až 3 dnů.

Izolace plasmidové DNA z kvasinek a sekvenování DNA

Plasmidy nesoucí cDNA p53 byly extrahovány z transformovaných kvasinkových buněk, které byly lyzovány lytickými enzymy Trichoderma harzianum (Sigma-Aldrich). Centrální část genu p53 byla amplifikována PCR s využitím primerů P3 a P4 a Taq polymerázy (Invitrogen). Produkt PCR byl extrahován z gelu pomocí MinElute PCR Purification Kit (Qiagen) a sekvenován pomocí BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) a sekvenátoru ABI PRISM 310 (Applied Biosystems).

Imunohistochemická analýza

Endogenní peroxidázová aktivita byla blokována 3% hydrogen peroxidem v metanolu po dobu 10 min. Demaskování epitopu bylo provedeno v citrátovém pufru pH 6,0 (Dako Denmark A/S) ve 121°C po dobu 4 min. p53 specifická protilátka DO-7 (Dako Denmark A/S) byla ředěna 1:2000 a aplikována přes noc. Reaktivní místa byla identifikována prostřednictvím biotinylované sekundární protilátky konjugované s peroxidázou ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), DAB (Dako Denmarks A/S) po obarvení Gillovým hematoxylinem.

Westernový přenos

Tkáně byly lyzovány v pufru obsahujícím 150 mM NaCl, 50 mM NaF, 50 mM Tris (pH 8,0), 5 mM EDTA, 1% NP40 a 1 mM inhibitor fenylmetylsulfonylfluoridové proteázy v ledové lázni po dobu 30 min. Zbytky buněk v buněčném extraktu byly odstraněny centrifugací (17000 g, 30 min). Pro přípravu kvasničných extraktů byly kolonie kvasinkových buněk inokulovány v médiu YPDA a kultivovány do dosažení optické hustoty OD₆₀₀ 0.8 - 1.0. Buňky byly propláchnuty ledovou sterilní vodou a lyzovány v lyzačním pufru obohaceném o 1 objem sterilních skleněných kuliček a promíchány vortexem každých 5 minut během následující hodiny. Lyzáty byly následně centrifugovány (17000 g, 30 min). Koncentrace proteinů byla stanovena podle Bradfordové. Solubilizované proteiny byly rozděleny 10% SDS-PAGE a přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Pro blokování nespecifických interakcí byly membrány promývány v 0.1% Tween 20 a 5% roztoku nízkotučného mléka v PBS po dobu 1 hodiny. Následně byly membrány inkubovány v roztoku protilátky anti-p53 DO-1 ve 4(C. Pro vyvolání blotů jsme používali králičí imunoglobulin konjugovaný s peroxidázou Dako a kit ECL pro detekci chemiluminisce (Amersham Biosciences).

Fluorescenční hybridizace in situ (FISH)

FISH jsme prováděli na tkáňových řezech připravených z parafinových tkáňových bločků fixovaných formalinem. Hybridizaci jsme prováděli se sondou LSIp53 specifickou pro lokus p53 a centromerickou sondou CEP 17 (Vysis) podle instrukcí výrobce. Obrázky byly skenovány mikroskopem Leica DMRXA2 vybaveným kamerou CCD (COHU). Fluorescenční signály byly analyzovány softwarem Leica Q-FISH (Leica).

Výsledky

Stanovení hladiny proteinu p53

Hladinu proteinu p53 v nádorové tkáni jsme analyzovali dvěma způsoby. Nejprve jsme provedli imunohistochemickou analýzu řezů z parafinových tkáňových bločků tkáně pomocí monoklonální anti-p53 protilátky DO-7. Silnou expresi p53 vykazovalo 95-100% jader nádorových buněk (obr. 2a). Následně jsme potvrdili vysokou hladinu p53 v nádorové tkáni westernovým přenosem s monoklonální protilátkou specifickou pro p53 DO-1. Tímto experimentem jsme zároveň zjistili, že v nádorových buňkách je kromě proteinu p53 o standardní molekulové hmotnosti přítomno také významné množství proteinu p53 s molekulovou hmotností zřetelně vyšší (obr. 2b).

FASAY

Technikou FASAY lze určit funkční stav p53 jednoduše podle barvy kolonií transformovaných kvasinkových buněk. Kvasinkové buňky exprimující funkční p53 tvoří na selekčním médiu velké hladké kolonie bílé barvy, zatímco kvasinkové buňky exprimující inaktivní p53 tvoří na tomto médiu malé hladké kolonie červené barvy. Status p53 se určuje podle poměru červených/bílých kolonií vzhledem k celkovému počtu kolonií rostoucích na selekčním médiu. Červené kolonie odpovídají nádorovým buňkám s mutantním p53 a bílé kolonie odpovídají jak nádorovým tak nenádorovým buňkách s funkčním p53. Frekvence červených kolonií vznikajících v důsledku degradace mRNA nebo nepřesným přiřazením nukleotidů během PCR obvykle nepřesahuje 10%, což je hranice pozadí. Kromě toho FASAY může zachytit mutace p53, které ovlivňují transaktivační schopnost p53 pouze částečně, např. mutace závislé na teplotě. V těchto případech se fenotyp kvasinkových kolonií odlišuje od standardních červených a bílých kolonií. Tyto kolonie jsou obvykle růžové nebo dvoubarevné červenobílé a jejich velikost dosahuje intermediární úrovně v důsledku částečné schopnosti proteinu p53 transaktivovat reportérský gen (Flaman et al., 1995, Pavlova et al., 2003).

Prvním krokem analýzy nádorové tkáně studovaného pacienta metodou FASAY je RT-PCR. Kvalitu a kvantitu získaného produktu PCR rutinně testujeme agarózovou gelovou elektroforézou, která nám v tomto případě ukázala vyšší molekulovou hmotnost amplifikované cDNA p53 ve srovnání se standardní kontrolou (obr. 3a). Transformace kvasinkových buněk tímto produktem PCR vedla k tvorbě bílých kolonií (6,8%), typických červených kolonií (4,0%) a neobvyklých červených kolonií s mnohonásobnými bílými skvrnami na svém povrchu (89,2%) (obr. 3b). Tento výslede naznačil, že gen p53 v nádorové tkáni pacienta je postižen takovou mutací, která umožňuje částečnou funkci p53.

Sekvenování cDNA p53

Jednou z výhod metody FASAY je, že umožňuje detekci klonálních mutací p53 i v těch případech, kdy je frakce nádorových buněk v analyzované tkáni příliš nízká pro přímé sekvenování DNA. cDNA p53 odvozenou z nádorové tkáně lze izolovat z transformovaných kvasinkových buněk a následně ji použít pro sekvenování (Pavlova et al. 2003, Nenutil et al. 2005, Trbusek et al. 2006). V tomto případě jsme inokulovali 4 „skvrnité“ kolonie, které jsme kultivovali samostatně přes noc v oddělených zkumavkách a z buněčných suspenzí jsme izolovali DNA. Purifikovaná DNA byla následně použita pro amplifikaci cDNA p53 pomocí PCR. Agarózová gelová elektroforéza amplifikované cDNA však ukázala, že mobilita produktů PCR převážně odpovídá p53 o standardní molekulové hmotnosti. Zaznamenali jsme přítomnost pouze malého množství produktů PCR o vyšší molekulové hmotnosti, které odpovídaly velikosti cDNA p53 získané přímo z nádorové tkáně a amplifikované PCR (obr. 4a). Proto jsem pro hledání mutace p53 sekvenováním nepoužili cDNA izolovanou z jednotlivých kvasinkových kolonií, ale cDNA připravenou přímo z nádorové tkáně (obr. 3a). Mutace nalezená v sekvenci p53 měla charakter duplikace o velikosti 30 pb (g.12155_12184dup30, GenBank) (obr. 5).

Analáza statutu p53 v kvasinkových koloniích

Každá jednotlivá kvasinková kolonie získaná metodu FASAY reprezentuje klon produkující jednu variantu p53 odvozenou z analyzované tkáně nebo vzniklou během RT-PCR. Původ různě velkých produktů PCR vytvořených amplifikací cDNA p53 z jednotlivých „skvrnitých“ kolonií byl proto nejasný (obr. 4a). Abychom tuto záhadu vysvětlili, analyzovali jsme dále status p53 v kvasinkových buňkách tvořících „skvrnité“ kolonie. Proteinové lyzáty získané z buněk kultivovaných v růstovém médiu jsme rozdělili SDS-PAGE a přítomnost proteinu p53 jsme vyhodnotili westernovým přenosem prostřednictvím monoklonální protilátky anti-p53 DO-1. Prokázali jsme však, že v každém vzorku je přítomen pouze protein p53 o standardní molekulové hmotnosti (obr. 4b). Bylo zajímavé, že pokud byly kvasinkové buňky kultivované v růstovém médiu vysety zpět na selekční agarovou půdu, vždy vytvořily pouze typické velké bílé kolonie odpovídající buňkám exprimujícím plně funkční p53.

Fluorescenční hybridizace in situ

Pro určení statutu p53 v nádorové tkáni jsme provedli interfázovou FISH na tkáňových řezech připravených z parafinových tkáňových bločků. Nejprve jsme sondou specifickou pro lokus p53 analyzovali 65 buněčných jader: detekovali jsme ztrátu jednoho signálu v 7 z nich (10,8%). Následně jsme provedli FISH se směsí sondy specifické pro lokus p53 s centromerickou sondou CH17. Všech 43 buněčných jader, která jsme podrobili analýze, vykazovalo 2 centromerické signály, 35 jader (81,4%) poskytlo 2 signály specifické pro lokus p53 a 8 jader (18,6%) poskytlo pouze 1 signál specifický pro lokus p53 (obr. 6).

Diskuse

Na rozdíl od jiných nádorově supresorových genů, má většina mutací p53 povahu bodových nukleotidových záměn. Substituce nukleotidů reprezentují přibližně 80% všech mutací p53 detekovaných u různých typů nádorů. Většina z nich postihuje oblast kódující DNA vazebnou doménu p53. Podstatně méně časté jsou u p53 mutace typu inzercí, krátkých delecí a mutací vedoucích ke vzniku předčasných terminačních kodónů. Tyto mutace navíc častěji postihují 5’ a 3’ konec genu p53 (Hainaut and Hollstein 2000, Olivier et al. 2004, Soussi et al. 2006, Petitjean et al. 2007). V této práci popisujeme neobvyklou mutaci p53 nalezenou v nádorové tkáni pacienta s Burkittovým lymfomem: duplikaci úseku vymezeného kodóny 77 a 87 o velikosti 30 pb, umístěnou mimo oblast kódující DNA vazebnou doménu. Provedli jsme podrobnou analýzu této mutace několika metodickými přístupy. Imunochemické analýzy prokázaly, že protein p53 je akumulován v nádorových buňkách ve vysoké míře, což naznačilo přítomnost mutace v genu p53. Westernovým přenosem jsme zjistili, že protein p53 syntetizovaný nádorovými buňkami má zřetelně zvýšenou molekulovou hmotnost. Technikou FASAY jsme dále prokázali, že rovněž gen kódující p53 v nádorové tkáni je neobvykle zvětšen. Elektroforetická pohyblivost proužku reprezentujícího produkt RT-PCR připraveného z nádorové tkáně byla zřetelně snížena ve srovnání s pohyblivostí produktu RT-PCR standardního p53. Sekvenováním cDNA p53 odvozené z nádorové tkáně jsme zjistili příčinu zvýšení molekulové hmotnosti molekuly p53: duplikaci fragmentu o velikosti 30 pb vymezeného kodóny 77 a 87. Metodou FASAY jsme jednoznačně prokázali, že protein p53 není v nádorové tkáni plně funkční. Frekvence pozitivních „skvrnitých“ kolonií dosáhla 90 %, což naznačuje absenci druhé alely p53 v nádorových buňkách. FISH však neprokázala tuto formu ztráty heterozygotnosti p53. Většina jader nádorových buněk byla zřetelně pozitivní pro oba signály specifické pro p53. Pomocí sond specifických pro lokus p53 a centromeru chromozomu 17 jsme vyloučili možnost, že by nádorové buňky byly tetraploidní. Stejný výsledek - diploidní charakter - prokázala i jiná verze FISH, zaměřená na detekci t(8;14) (q24;q32). O osudu druhé alely genu p53 v nádorových buňkách tedy můžeme pouze spekulovat. Jedna možnost spočívá v tom, že nemutovaná alela p53 by sice mohla být fyzicky přítomná, a proto detekovatelná FISH, ale neexprimovaná, a proto poskytující negativní signál při FASAY (RT-PCR). Utlumení genové exprese může být vyvoláno geneticky (např. mutací v oblasti promotoru) nebo epigeneticky (např. metylací promotoru). Další možností je, že exprese druhé alely není utlumena, ale alela je mutována takovým způsobem, který vylučuje její zachycení metodou FASAY. Například by se mohlo jednat o mutaci v místě nasedání primeru. A konečně nelze vyloučit ani možnost, že
v obou alelách p53 je přítomna stejná mutace. Pravděpodobnost, že stejná mutace nastane nezávisle dvakrát, je velmi nízká, téměř nulová. Nelze však vyloučit možnost genové konverze nebo mitotické rekombinace.

Morfologie „skvrnitých“ kvasinkových kolonií vzniklých při FASAY byla velmi neobvyklá. Podobně nečekané bylo i chování kvasinkových buněk v některých dalších analýzách stavu p53. Dosud jsme při obdobných analýzách standardně potvrzovali stejné vlastnosti genů, resp. proteinů p53 v nádorových buňkách a odpovídajících transformovaných kvasinkových buňkách (Smardova et al. 2005). V prezentovaném případě měla cDNA p53 odvozená z nádorových buněk vyšší molekulovou hmotnost než standardní cDNA p53, avšak cDNA získaná z transformovaných kvasinkových buněk měla standardní velikost nebo byla směsí obou těchto variant cDNA. Na proteinové úrovni zvětšené varianty p53 nebyly přítomny v kvasinkových buňkách vůbec. Předpokládáme, že tento jev je důsledkem nestability inzertu v kvasinkách. Kvasinkové buňky transformované variantou cDNA p53 obsahující duplikaci tvořily při FASAY malé červené kolonie, což naznačuje nefunkční stav p53. Avšak během prodloužené kultivace se morfologie původně červených kolonií mění. Během tří dnů se na povrchu těchto kolonií začnou objevovat malé bílé skvrny, které se během další kultivace rychle zvětšují (obr. 3b). Předpokládáme, že tyto bílé skvrny reprezentují subklony kvasinkových buněk, které ztratily duplikovaný fragment DNA a obnovily funkci p53. Buňky obsahující funkční p53 získávají růstovou výhodu, protože mohou tvořit vlastní adenin a postupně přerůstají buňky s mutovaným p53, které jsou limitovány nízkým obsahem adeninu v selekčním médiu (Flaman et al. 1995). Důsledkem je pak přítomnost zvětšujících se bílých skvrn na povrchu červených kvasinkových kolonií. Pro izolaci cDNA p53 z transformovaných kvasinkových buněk dostačuje krátká doba kultivace v malém objemu média. Tyto podmínky umožňují přítomnost zbytkových variant nádorových cDNA p53, které jsme detekovali agarózovou elektroforézou. (obr. 4a). Pro analýzu proteinu p53 produkovaného kvasinkami je potřeba buňky kultivovat ve větším objemu média a delší dobu. Tyto podmínky postačují k tomu, aby reparační mechanismy odstranily duplikaci a zvětšené varianty proteinu p53 vymizely. Proto jsme westernovým přenosem detekovali pouze protein p53 o standardní molekulové hmotnosti (obr. 4b).

Funkční analýza v kvasinkách se často používá pro analýzu statutu p53 a všeobecně se pokládá za velmi spolehlivou. Prezentovaný kuriózní příklad naznačuje možná omezení pro použití kvasinkových buněk pro analýzy lidského genu p53. Ukázali jsme, že některé mutace p53 mohou být v kvasinkách nestabilní. Na druhou stranu, samotná metoda přítomnost inaktivující mutace p53 jednoznačně prokázala, a to reprodukovatelně, a bizarní morfologie kvasinkových kolonií dokonce naznačila její neobvyklou povahu. Tyto výsledky proto poskytují další důkaz, že FASAY je skvělá metoda pro funkční analýzy p53.

Poděkování

Práce je podporována grantem NR/9305-3 IGA MZ ČR a MŠM 0021622415.

Reference

1. H. G. Drexler, S. Fombonne, Y. Matsuo, Z.B. Hu, H. Hamagichi, C. C. Uphoff. p53 alterations in human leukemialymphoma cell lines: in vitro artifact or prerequisite for cell immortalization?, Leukemia 14 (2000) 198-206.
   
2. J. M. Flaman, T. Frebourg, V. Moreau, F. Charbonnier, C. Martin, P. Chappuis, A. P. Sappino, J. M. Limacher, L. Bron, J. Benhattar, M. Tada, E. G. Van Meir, A. Estreicher, R. D. Iggo. A simple p53 functional assay for screening cell lines, blood, and tumors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 3963-3967.
   
3. P. Hainaut, M. Hollstein. p53 and human cancer: The first ten thousand mutations, Adv. Canc. Res. 77 (2000) 81-137.
   
4. C. Ishioka, T. Frebourg, Y.X. Yan, M. Vidal, S. H. Friend, S. Schmidt, R. Iggo. Screening patients for heterozygous p53 mutations using a functional assay in yeast, Nat. Genet. 5 (1993) 124-129.
   
5. A. J. Levine, W. Hu, Z. Feng. The p53 pathway: what questions remain to be explored?, Cell Death Differentiation 13 (2006) 1027-1036.
   
6. M. S. Lindstrom, K.G. Wiman. Role of genetic and epigenetic changes in Burkitt lymphoma, Semin. Cancer. Biol. 12 (2002) 381-387.
   
7. R. Nenutil, J. Smardova, S. Pavlova, Z. Hanzelkova, P. Miller, P. Fabian, R. Hrstka, P. Janotova, M. Radina, D. P. Lane, P. J. Diates, B. Vojtesek. Discriminating functional and non-functional p53 in human tumours by p53 and MDM2 immunohistochemistry, J. Pathol 207 (2005) 251-259.
   
8. M. Olivier, R. Eeles, M. Hollstein, M. A. Khan, C. C. Harris, P. Hainaut. The IARC TP53 Database: new online mutation analysis and recommendations to users, Hum.Mutat. 19 (2002) 607-614.
   
9. M. Olivier, S. P. Hussain, C. C. de Fromentel, P. Hainaut, C. C. Harris. TP53 mutation spectra and Load: A tool for generating hypotheses on the etiology of cancer, IARC Sci Publ. 157 (2004) 247-70.
   
10. A. Petitjean, M. I. W. Achatz, A.L. Borresen-Dale, P. Hainaut, M. Olivier. TP53 mutations in human cancers: functional selection and impact on cancer prognosis and outcomes, Oncogene 26 (2007) 2157-2165.
    
11. J. Smardova, A. Nemajerova, M. Trbusek, V. Vagunda, J. Kovarik. Rare somatic p53 mutation identified in breast cancer: A case report, Tumor Biol. 22 (2001) 59-66.
    
12. J. Smardova, S. Pavlova, M. Svitakova, D. Grochova, B. Ravcukova. Analysis of p53 status in human cell lines using a functional assay in yeast: Detection of new non-sense p53 mutation in codon 124, Oncology Rep. 14 (2005) 901-907.
    
13. T. Soussi, B. Asselain, D. Hamroun, S. Kato, C. Ishioka, M. Claustres, C. Beroud. Meta-analysis of the p53 mutation database for mutant p53 biological activity reveals a methodological bias in mutation detection, Human Cancer Res. 12 (2006) 62-70.
    
14. M. Trbusek, J. Malcikova, J. Smardova, V. Kuhrova, D. Mentzlikova, H. Francova, S. Bukovska, M. Svitakova., P. Kuglik, V. Linkova, M. Doubek, Y. Brychtova, J. Zacal, J. Kujickova, S. Pospisilova, D. Dvorakova, J. Vorlicek, J. Mayer. Inactivation of p53 and deletion of ATM in B-CLL patients in relation to IgVH mutation status and previous treatment, Leukemia 20 (2006) 1159-1161.
    
15. M. Trkova, L. Torerova, R. Kodet, P. Hedvicakova, Z. Sedlacek. A Li-Fraumeni syndrome family with retained heterozygosity for a germline TP53 mutation in two tumors, Cancer Genet. Cytogenet 145 (2003) 60-64.
    
16. Y. Yang, C.C.H. Li, A.M. Weismenn. Regulating the p53 system through ubiquitination, Oncogene 23 (2004) 2096-2106.
    
17. M. Wilda, J. Bruch, L. Nardet, D. Rawer, A. Reiter, A. Borkhardt, W. Woessmann. Inactivation of the ARF-MDM- 2-p53 pathway in sporadic Burkitt’s lymphoma in children, Leukemia 18 (2004) 584-588.

Legendy

Obr. 1: Analýza nádorové tkáně.

Mikroskopický snímek řezu nádorové tkáně po obarvení hematoxylinem vykazuje typický obraz „hvězdného nebe“.

Obr. 2: Určení hladiny proteinu p53 v nádorové tkáni.

(a) Imunohistochemická detekce proteinu p53 v nádorové tkáni s využitím monoklonální protilátky DO-7.

(b) Proteinový extrakt z buněk kontrolní linie odvozené z lidského karcinomu prsu (1, pozitivní kontrola) a nádorové tkáně (2) byl rozdělen SDS-PAGE a buď analyzován westernovým přenosem (horní část) nebo obarven Coomassie brilliant blue (spodní část).

Obr. 3: Funkční analýza separovaných alel v kvasinkách.

(a) cDNA standardního (1) a nádorového p53 (2) amplifikovaná RT-PCR připravená pro transformaci kvasinkových buněk byla rozdělena agarózovou gelovou elektroforézou a obarvena ethidium bromidem.
(b Morfologie kvasinkových kolonií ilustruje výsledky FASAY po třech a pěti dnech kultivace: směs bílých (6,8%), červených (4,0%) a „skvrnitých“ kolonií (89,2%). Vlevo dole je dokumentován charakter „skvrnitých“ kolonií při větším zvětšení.

Obr. 4: Analýza stavu p53 ve „skvrnitých“ kvasinkových koloniích.

(a) cDNA p53 čtyř kolonií transformovaných kvasinek (’1 - 4) po amplifikaci PCR. Jako kontrola byly použity kvasinkové buňky exprimující standardní typ cDNA p53 (WT) a produkt RT-PCR odvozený z nádorové tkáně (TT).

(b) Proteinové extrakty připravené ze dvou kvasinkových kolonií byly rozděleny SDS-PAGE a buď analyzovány westernovým přenosem monoklonální protilátkou DO-1 (horní část) nebo obarveny Coomassie brilliant blue (spodní část). Jako pozitivní kontrola byly použity kvasinkové buňky exprimující standardní p53 (WT).

Obr. 5: Nukleotidová sekvence cDNA p53 odvozené z nádorové tkáně.

Čísla nad nukleotidovou sekvencí označují pořadí nukleotidů v genomové DNA (GeneBank), čísla pod sekvencí udávají pořadí kodónů v cDNA.

Obr. 6: Ztráta p53 specifického lokusu detekovaná pomocí FISH.

Mikroskopické preparáty byly připraveny z formol-parafinových bločků testované tkáně standardním postupem. Hybridizaci se sondou LSIp53 specifickou pro lokus p53 17p13 (oranžový signál) a centromerickou sondou CEP 17 (zelený signál) jsme sledovali fluorescenční mikroskopií.

Obr. 1



Obr. 2



Obr. 3a



Obr. 3b



Obr. 4



Obr. 5



Obr. 6