Optimalizace amplifikace a prvotní výsledky mutační analýzy exonů genů receptorových tyrosinkináz c-kit a pdgfralfa u pacientů s gastrointestinálním stromálním tumorem

Gastrointestinální stromální tumory (GISTy) patří mezi nejčastější mesenchymální nádory gastrointestinálního traktu. Morfologicky, imunofenotypově i geneticky jsou GISTy definovanou skupinou nádorů, odlišnou od jiných nádorů měkkých tkání lokalizovaných v gastrointestinálním traktu. U většiny GISTů je charakteristická exprese receptorového proteinu KIT (CD 117). Konstitutivní mutace genů c-kit a pdgfralfa (plateled derived growth factor receptor alpha) hrají významnou roli v patogenezi vzniku GISTů. Jedná se o mutace typu substituce jednonukleotidových bází, složitější delece, delece-inzerce, inzerce nebo duplikace. Výsledkem mutací je na ligandu nezávislá aktivace receptorových tyrosinkináz KIT nebo PDGFRalfa, s následným spuštěním signálních drah, vedoucích v konečném důsledku k expresi molekul zapojených do kontroly buněčné proliferace, diferenciace, prodlouženého přežívání nebo inhibice programované smrti buňky. Mutace v těchto genech se nevyskytují se společně, jsou navzájem exkluzivní. Význam analýzy mutací v genech c-kit a pdgfralfa spočívá nejen v poznání mechanismu vzniku nemoci a v komplexní diagnostice GISTů ale rovněž má klinicko-terapeutický dopad, vzhledem k prediktivní hodnotě chování nádoru s definovaným typem mutací na terapii Imatinib mesylátem. Imatinib mesylát je účinným inhibitorem aktivovaných receptorových tyrosinkináz KIT a PDGFRalfa u pacientů s neoperabilním, metastazujícím nebo recidivujícím GISTem. Nádory s mutacemi v regulačních oblastech genů c-kit a pdgfralfa (u genu c-kit jde o exony 11 a 9, u genu pdgfralfa o exon 12) se považují za tumory senzitivní na terapii, zatímco nádory s mutacemi v tyrosinkinázových doménách (exony 13 a 17 u c-kitu a exony 14 a 18 u genu pdgfralfa) za primárně rezistentní na léčbu. Zdrojem materiálu pro studii mutační analýzy genů c-kit a pdgfralfa byly vzorky tkání od pacientů s morfologicky a imunohistochemicky verifikovanou diagnózou gastrointestinálního stromálního tumoru. Jednalo se jednak o vzorky zmražených čerstvých tkání a jednak, ve většině případů, o vzorky tkání fixovaných ve formolu a zalitých do parafínu. Pro metody molekulární biologie, stejně jako pro mutační analýzu je důležitá kvalita vzorku. U DNA izolované ze vzorků získaných z parafínových bločků se setkáváme se sníženou kvalitou. Důvodem je degradace nukleových kyselin způsobena procesy souvisejícími se zpracováním vstupního materiálu (použité fixační činidlo, procesy odvodnění, zalévání do parafínu). S použitím dvou amplifikačních master mixů, HotStarTaq® Mas¬ter Mix Kitu (Qiagen, Hilden, Germany) a termostabilní AmpliTaq® Gold polymerázy (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), byla optimalizována amplifikace exonů 9, 11, 13 a 17 genu c-kit a exonů 12, 14 a 18 genu pdgfralfa. DNA izolovaná ze zmraženého materiálu byla velmi dobré kvality, zatímco DNA získaná izolací z parafinových bloků byla dobré a slabší kvality. Ze získaných DNA jsme amplifikovali výše uvedené exony. Výrazné rozdíly v citlivosti a specifičnosti detekovaných produktů nebyly zjištěné. Oba amplifikační systémy byly stejně vhodné i pro amplifikaci exonů o nižší kvalitě izolované DNA. Detekce mutací byly v naši laboratoři provedeny pomocí asymetrické sekvenační PCR (polymerásové řetězové reakce) s následnou analýzou pořadí nukleotidů pomocí kapilární elektroforézy na genetickým analyzátoru ABI PRISM 310. Nejčastěji jsme detekovali mutace v exonu 11 genu c-kit, ve shodě s publikovanými údaji o největším výskytu mutací právě v této oblasti. Zjistili jsme delece, delece-inzerce a substituce nukleotidových bází. V jednom případě jsme detekovali jednonukleotidovou substituci adeninu (A) za guanin (G) v kodonu 496 exonu 9 c-kitu, čehož následkem byla záměna kyseliny asparagové za asparagin. Zjištěné mutace byly u každého pacienta verifikovány opětovným provedením analýzy a porovnáním sekvence vzorku pacienta s referenční sekvencí genů c-kit a pdgfralfa získanou z databáze http:// www.ncbi.nlm.nih.gov a sekvencí vyšetřenou ze vzorku od zdravého člověka.

Tento projekt byl podporován výzkumným záměrem FNM MZO 00064203.