Prognostické a prediktivní faktory karcinomu prsu a jejich vzájemný vztah

Výsledky léčby karcinomu prsu, které jsou stále nedostatečné, stimulují k hledání nových, především molekulárně patologických markerů, které by zpřesnily diagnózu a tím cílily přesněji léčbu. V naší studii jsme stanovovali klinické a histopatologické charakteristiky nemetastazujícího karcinomu prsu, velikost primárního nádoru, přítomnost infiltrace spádové lymfatických uzlin, grading, expresi hormonálních receptorů, c-erb-2 proteinu (HER) a ploiditu DNA a zjišťovali jsme jejich možné vzájemné korelace, s cílem upřesnit míru rizika onemocnění.

1. Zdůvodnění cílů studie

V práci jsme se zaměřili na zjištění možné korelace mezi standardními faktory a expresí ERBB-2 (HER-2) proteinu a buněčnou ploiditou. Množství nádorové DNA v buňce je pokládáno za jeden z možných indikátorů prognózy. Podle řady literárních údajů je DNA aneuploide u karcinomu prsu známkou horší prognózy, častěji provází postižení uzlin, větší nádor (T2 a T3), vyšší grade a absencihormonálních receptorů.

První metodou průkazu přítomnosti HER-2 bylo imunohistochemické stanovení pomocí protilátek proti HER-2 proteinu. Dnes je standardně používána pro diagnostiku diagnostická souprava firmy Dako HercepTest, který byl schválen FDA (Federal Drug Administration). Na základě intenzity exprese ERBB-2 proteinu zjištěné tímto standardizovaným systémem se tumory rozdělují do čtyř skupin. U nejednoznačné nebo hraniční pozitivity exprese proteinů HER-2 využíváme metodu FISH (fluorescenční in situ hybridizace), která pomocí fluorescenčně značených sond stanoví počet kopií HER-2 genu a počet signálů pro centromeru chromosomu 17. Zvýšený počet kopií (amplifikace) genu HER-2 koreluje, ve většině případů, se zvýšenou expresí proteinu.

2. Použité metody ve studii

2.1. Charakteristika souboru

V naší práci hodnotíme soubor nemocných, které v letech 1999 až 2004 byly vyšetřeny na Radioterapeuticko - onkologickém odděleni a jejichž molekulárně - patologická diagnostika byla provedena na Ústavu patologie a molekulární medicíny. Všechny nemocné podstoupily radikální modifikovanou mastektomii s exenterací axily. Klinické stádium bylo určeno dle TNM klasifikace WHO. Celkem jsme do našeho sledování zařadili 77 nemocných. Průměrný věk pacientek byl 59,3 let, nejmladší bylo 33 a nejstarší 88 let. Nejčastěji se vyskytovaly nádory T1 53%, T2 39%, T3 5%. 57% nemocných nemělo přítomny metastázy v axilárních lymfatických uzlinách. Vyšší nádorový grade 3 převažoval u větších tumorů, T2 62% a T3 66%, (tab. 1), 77% tumorů exprimovalo hormonální receptory. Exprese HER byla prokázána u 21 tumorů T1, u 13 T2 a u 1 T3. 47 nádorů bylo diploidních, aneuploidita byla zjištěna u 13 nádoru T1, u 14 T2 a u 2 T3.

2.2 Imunohistochemické vyšetření. Cytometrická DNA analýza

Z každého bločku tkáně byl připraven jeden řez o síle 5 μm a 2–4 silné řezy (podle velikosti zalité tkáně) o síle 50 μm. Tenký řez byl obarven hematoxylinem-eosinem a použit k histologickému vyšetření jako kontrola zda vzorek skutečně obsahuje nádorovou tkáň. Silné řezy byly použity k vlastní DNA analýze.

Deparafinizaci a přípravu suspenze holých jader jsme prováděli v modifikaci podle Robinsona). Řezy byly ve zkumavce deparafinizovány v xylenu a rehydratovány sestupnou řadou alkoholů. Poté byly řezy v destilované vodě uloženy přes noc do lednice. Řezy jsme rozstříhali na drobné kousky a inkubovali s 0,25% roztokem pepsinu v ředěné kyselině chlorovodíkové za stálého třepání, pokud se částečky tkáně nerozpadly (½- 2 hodiny). 25 μl tekuté složky jsme odebrali do cytometrické zkumavky, do které jsme přidali 25 μl permeabilizačního činidla (roztok šetrného detergentu permeabilizující buněčnou a jadernou membránu) a 500 μl barvícího činidla (roztok propidium jodidu s RNázou) ze soupravy DNA Prep reagent kit (Becman Coulter)). Po nejméně půlhodinové inkubaci jsme vzorky měřili na průtokovém cytometru FACSCalibur (BD). Vyhodnocení DNA indexu a procenta jednotlivých fází buněčného cyklu jsme prováděli v programu ModFit.

3. Výsledky

V souboru mírně převažovaly nádory špatně diferencované gradu 3–37,7% nemocných, 32,4% nemocných mělo grade 2 a u 10,4% byl zjištěn grade 1, u 19,5% nebyl grade znám. U 75 nemocných byla zjištěna pozitiva receptorů pro estrogen α a u 58 nemocných pozitivita receptorů pro progesteron. Imunohistochemické vyšetření exprese c-erb-2 (HER) proteinu bylo provedeno u 73 nemocných. Silná exprese c-erb (3+) byla prokázána u 13 nemocných, střední (2+) u 22 nemocných a slabá – hodnoceno negativní (1+) u 27 nemocných a 11 nemocných bylo skóre 0 (hodnoceno negativní). Závislost exprese HER, hormonálních receptorů a ploidity na stádiu T nedosáhlo statistické významnosti. Jediná nalezená statisticky významná závislost byla mezi gradem a velikostí nádoru, kdy tumory o průměru do 2 cm (T1) měly významně častěji grade 1 nebo 2 (p <0,05, test χ² jako kontingence 2x2). U estrogenních receptorů a progesteronových receptorů nebyla prokázána statisticky významná závislost na velikosti tumoru, ale je evidentní tendence pozitivity hormonálních receptorů (jednoho a více u obou) v souvislosti se stádiem T1 a T2.

U výskytu aneuploidie nebyla prokázána statisticky významná závislost na velikosti tumoru, avšak nádory T1 a T2 mají jednoznačně vyšší počet nemocných bez výskytu aneuploidie.

66,7% nemocných exprimujících receptory pro progesteron bylo HER negativních, 50% estrogen receptor pozitivních nádorů bylo HER negativních a 57,2% estrogen a progesteron pozitivních bylo HER negativních. Tyto výsledky nedosahovaly statistické významnosti.

Aneuploidní nádory byly v 55,6% HER negativní, diploidní byly v 48% HER pozitivní a převažovaly u špatně diferencovaných tumorů gradu 2 a 3, tj. v 87,5%. Špatně diferencované tumory byly v 55,2% HER pozitivní. 46,7% tumorů exprimujících receptory pro estrogen α a progesteron bylo diploidních. Korelace mezi ploiditou a stavem hormonálních receptorů nedosahovala statistické významnosti.

4. Diskuze

Při hledání statisticky významné závislosti mezi velikostí primárního nádoru, stavem infiltrace axilárních uzlin a histologickým gradem, expresí hormonálních receptorů, overexpresí onkogenu c-erb-B2 na membránách nádorových buněk a aneuploiditou jsme zjistili jedinou statisticky významnou závislost mezi velikostí tumoru a histologickým gradem. V našem souboru tumory menší než 2 cm byly dobře či středně diferencované, tedy nádory s lepší prognózou. HER pozitivita byla prokázána častěji u nižších stádií onemocnění T1 52,5% a T2 44,8%. V našem souboru největší skupina nemocných se špatně diferencovanými tumory byla HER pozitivní (55,2%). Špatně diferencované nádory gradu 3 převažovaly u tumorů větších než 2 cm (T2, T3). Bez exprese hormonálních receptorů byly nejčastěji nádory větší než 2 cm, T2 28,6%. Nádory stádia T1 měly pozitivitu alespoň jednoho hormonálního receptoru.

V našem souboru při rozložení na čtyři skupiny dle exprese hormonálních receptorů jsme zjistili nejčetnější výskyt HER negativních tumorů u nemocných ER-/PR+ a ER+/PR+. V našem souboru pacientek jsme neprokázali statisticky významnou korelaci mezi pokročilejším onemocněním a výskytem aneuploidie. Ale zaznamenali jsme určitý trend, kdy tumory menší než 2 cm (T1) byly nejčastěji diploidní (68%) a u tumorů vyššího stádia nebyl rozdíl ve výskytu aneuploidity (T2 46%, T3 50%). Nádory s pozitivní expresí hormonálních receptorů byly v našem souboru většinou diploidní. Statisticky významně vyšší podíl aneuplodních nádorů ve střední věkové kategorii v našem souboru přisuzujeme méně četnými chromozomálními aberacemi u mladších nemocných. Hledání korelace imunohistochemických parametrů s klinickými znaky nádorů může vést nejenom ke zpřesnění diagnostiky, ale i k přesnější typizaci nádorů. Na základě detailnější diagnózy a typizace onemocnění, přesného stanovení míry rizika pro pacientku, je možné určit léčebnou strategii, a to je přítomnost a budoucnost protinádorové léčby.