Proliferace a apoptóza specifických buněčných populací získaných laserovou mikrodisekcí a detekovaných průtokovou cytometrií

Buněčnou a molekulární analýzu tkáňových vzorků často komplikuje jejich heterogenní struktura, proto je třeba před samotnou analýzou připravit homogenní buněčné populace. K získání jednotlivých buněčných typů v suspenzi se dlouhou dobu používá separace na principu průtokové cytometrie (FACS – sorter), avšak aplikace tohoto postupu na vzorky tkáně je časově velmi náročná. Laserová mikrodisekce (LCM) umožňuje bezkontaktní izolaci specifických buněčných populací přímo z tkáňových či buněčných preparátů in situ. Malé množství buněk získaných laserovou mikrodisekcí limituje použití běžných technik proteinové analýzy (2D elektroforéza, Western blot), kde není možná amplifikace jako na úrovni nukleových kyselin.

K překonání tohoto problému jsme navrhli nový postup pro analýzu vybraných proteinů spojených s buněčnými procesy jako jsou apoptóza a proliferace specifických tkáňově vázaných buněčných populací. Metoda je založena na laserové mikrodisekci kryoprezervovaných tkání (orgánů) s následným enzymatickým rozvolněním mikrodisekovaných oblastí. Po převedení do suspenze se v jednotlivých buňkách našeho zájmu detekuje příslušný parametr pomocí průtokové cytometrie. K zavedení této metody jsme vybrali vysoce proliferující oblasti zubního základu myšího embrya (cervikální smyčky) a srovnali je s apoptotickou populací (primární sklovinný uzel). Proliferaci jsme detekovali pomocí PCNA (proliferating cell nuclear antigen) antibody a imunohistochemie in situ. Průkaz apoptózy byl založen na detekci kaspázy-3 a srovnání s TUNEL testem (detekce DNA zlomů), M30 Cytodeath (detekce apoptoticky štěpeného cytokeratinu-18) a imunohistochemií in situ. Dále tyto postupy uplatňujeme při studiu nádorové tkáně.

Příprava vzorků

Pro zavedení a optimalizaci metody jsme použili myší embryo (stáří 15,5 dne), jehož hlava byla bezprostředně po vyjmutí z dělohy matky zamražena v tekutém dusíku. Krájením na kryomikrotomu jsme získali příčné řezy obsahující zubní základy molárů. Tyto řezy jsme nanesli na podložní skla s PALM membránou, minutu sušili při pokojové teplotě a obarvili trypanovou modří pro lepší vizualizaci. Trypanovou modř jsme nakapali na řez a ihned omyli roztokem s inhibitory proteáz. Poté jsme provedli laserovou mikrodisekci pomocí přístroje Olympus Microbeam microscope se záchytem disekované tkáně do víčka mikrozkumavky obsahujícího 20 µl PBS s inhibitory proteáz. Následně jsme tkáň rozvolnili trypsinem (2 hodiny, 37°C), resuspendovali, centrifugovali 5 minut při 2500 g a dvakrát promyli roztokem PBS s 0,2% albuminem. Buňky byly dále zpracovány dle příslušné metodiky (Roche) tj. fixace, permeabilizace, následované fluorescenčním značením principem imunochemickým či napojováním značených nukleotidů na apoptotické zlomy DNA. Po promytí následovala detekce fluorescence průtokovým cytometrem.

Kombinace laserové mikrodisekce s průtokovou cytometrií přestavuje vhodnou metodu pro detekci specifických antigenů při malém množství buněk. Tuto metodu jsme aplikovali také na detekci proliferující a apoptotické oblastí tumoru a je tedy možné ji v budoucnu použít při sledovaní biologických parametrů nádorových onemocnění na podrobnější úrovni.

Tato práce byla podpořena grantem Ministerstva zdravotnictví číslo MZ000209805, grantem GAAV číslo KJB500450802 a grantem GA ČR číslo 203/08/1680.