Konference: 2004 XXVIII. Brněnské onkologické dny a XVIII. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Onkologická diagnostika
Téma: Molekulární a laboratorní diagnostika nádorů
Číslo abstraktu: 44
Autoři: J. Zelená; Jan Vacek; Mgr. Jitka Petrlová, Ph.D.; J. Hradecký; doc.Ing. René Kizek, Ph.D.
Kalibrační křivka byla lineární (y = 0,5582x m+ 3,0414) v rozsahu 4 až 200 µg MT/ml s R2 = 0,9989. Vyvinutá metodika významně přispívá k možnostem detekce MT markeru pomocí průtokové analýzy s elektrochemickou detekcí.
Klíčová slova
metalothionein, nadměrná exprese, prognostický marker, stanovení MT, elektrochemické metody, průtoková injekční analýza, FIA, chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza, elektrochemický detektor
Zkratky
MT: metalothionein, hMT: lidský metalothionein, SH: sulfhydrylová skupina, HPLC: vysoko-účinná kapalinová chromatografie, DPV: diferenční pulzní voltametrie, AdTS CPSA: adsorptivní přenosová technika kombinovaná s chronopotenciometrickou rozpouště cí analýzou za konstantního proudu, ED: elektrochemický detektor, TFA: kys. trifluorooctová, ACN: acetonitril, FIA: průtoková injekční analýza.
1. Úvod
Metalothioneiny (MT) patří do skupiny intracelulárních na cystein bohatých proteinů o molekulové hmotnosti od 6 do 10 kDa. Díky své vysoké afinitě k zinku, mědi nebo kadmiu, je jejich hlavní funkcí homeostatická kontrola a detoxikace iontů těžkých kovů na buněčné úrovni. MT jsou rozděleny do tříd MT-I a MT-II s ohledem na jejich primární strukturu a organismus, ze kterého byly izolovány. Třída MT-I zahrnuje savčí metalothioneiny tvořené 61-68 aminokyselinami. V těchto proteinech nejsou přítomny aromatické aminokyseliny a 20 cysteinů se v primární sekvenci vyskytuje nejčastěji v těchto repeticích: Cys-X-Cys, Cys-Cys-X-Cys-Cys, Cys-X-Cys-Cys (X: jiná aminokyselina než abcystein). MT se skládají ze dvou vazebných domén (α, β), které jsou složeny z cysteinových molekul přičemž kovalentní vazby atomů kovů se účastní sulfhydrylové (SH) zbytky. N-terminální bčást peptidu je označena jako β-doména a má tři vazebná místa. V případě α-domény (C-terminální části) byla potvrzena schopnost vyvázat čtyři ionty kovů (obr.1) (Kägi and Kojima, 1987).
![](/files/abstrakta/2004BOD_44_01.jpg)
Isoformy metalothioneinů a jejich exprese v lidské tkáni
Lidské MT jsou kódovány rodinou genů vytvářejících 10 isoforem. Vzniklé proteiny jsou rozděleny do čtyř skupin: hMT-1, hMT-2, hMT-3 a hMT-4. V organismu dospělých jedinců jsou nejvíce zastoupeny isoformy hMT-1a a hMT-2a, které se exprimují ve většině lidských tkáních (Vašák and Hasler, 2000). Tyto isoformy jsou obvykle exprimovány ve velmi malých koncentracích a jejich exprese výrazně stoupá při indukci mnoha exogenními a endogenními faktory jako jsou těžké kovy (Cd, Cu, Pt, Zn, Pb aj.), stresové hormony, kyslíkové radikály, cytokininy a nejrůznější xenobiotika (Kägi, 1993).
Spojitost nadměrné exprese hMT s progresí onemocnění
V posledních deseti letech je zkoumána nadměrná exprese (overexprese) hMT v nádorových tkání. Tato exprese je převážně spojena s maligními nádory a je studována jako nový prognostický marker v progresi onemocnění, přežití pacientů, korelací s histologickým typem nádoru a nádorovým gradingem. (Cardoso et. al. 2002; Douglas-Jones et. al. 1995; Weinlich et. al. 2003; Jasani and Schmid 1997; Joseph et. al. 2001; Kuo and Lo 1997) Overexprese hMT je nejčastěji detekována imunohistochemicky v parafínových řezech s použitím monoklonální myší protilátky E9 proti isoformám hMT-1a a hMT-2a (Jasani and Elmes 1993). Hladina těchto isoforem převážně stoupá u maligních, více gradingovaných nádorů u karcinomu prsu, u kožních karcinomů a melanomů, cervikálních karcinomů, akutní lymfoblastické leukémie, karcinomů pankreatu a je významně spojena s progresí a horší prognózou v nádorovém onemocnění (Jasani and Schmid 1997). Naopak nadměrná exprese hMT sdružená s méně gradingovanými nádory byla určena u karcinomu tlustého střeva, karcinomu močového měchýře a fibroblastických kožních nádorů (Jasani and Schmid 1997).
Stanovení MT
Ke stanovení MT je využíváno široké spektrum metod chemické analýzy (Dabrio et. al. 2002), viz. obr. 2. K separaci MT se nejčastěji využívají chromatografické metody, které lze rozdělit na dvě skupiny. Jednak jde o metody využívající separace za vyššího tlaku (HPLC). Jako stacionární fáze se zde často využívá reverzních fází s chemicky vázaným oktylem nebo oktadecylem v kombinaci s polární mobilní fází. Pro detekci se obvykle využívá UV-Vis detektor diodového pole. Druhou skupinu představuje metoda nízkotlaké chromatografie: FPLC (vylučovací chromatografie), kde separace probíhá na základě rozdílné molekulové hmotnosti látek obsažených ve vzorku. Kromě nejběžněji používané UV-Vis detekce lze úspěšně stanovit nízké koncentrace MT elektrochemickými metodami. Elektrochemické metody jako je voltametrie zapojená v diferenčním pulzním módu (DPV) nebo derivativní chronopotenciometrie s konstantním proudem (CPSA) umožň ují stanovení nanomolárních koncentrací MT. Tyto analytické postupy vycházejí z elektrodových reakcí, které jsou provázeny vylučováním vodíku ze složek základního elektrolytu. CPSA v kombinací s technikou adsorptivního přenosu (AdTS) umožň uje stanovovat koncentrace MT na úrovni femtomolů ve velmi malých mobjemech (jednotky µl) vzorku.
Obr. 2.
Analytické instrumentální metody používané pro separaci a detekci MT. Více podrobností je uvedeno v práci.
![](/files/abstrakta/2004BOD_44_02.jpg)
V naší práci jsme se zaměřili na stanovení MT pomocí chronoptenciometrické rozpouštěcí analýzy na rtuťové kapkové elektrodě a průtokové injekční analýzy s elektrochemickou detekcí.
2. Materiál a metody
Chemikálie
Acetonitril (ACN) a kyselina trifluorooctová (TFA) byly získány od firmy Merck (Darmstadt, Germany). Zásobní roztoky standardu metalothioneinu (MT-1a, izolát z králičích jater, Mr 7120 Da) v mkoncentraci 400 g/ml byly připraveny v ACS vodě (Aldrich, USA) a uchovány při –20°C. Pracovní roztoky byly ze zásobního připravovány každý den nové.
Elektrochemická analýza
Chronopotenciometrická rozpouštěcí analýza (CPSA) byla prováděna pomocí elektrochemického analyzátoru AUTOLAB (EcoChemie, Netherlands) v zapojení s tříelektrodovou celou VA-Stand 663 (Metrohm, Switzerland). Pracovní elektroda – HMDE (plocha rtuťové kapky: 0.4 mm2), referenční elektroda (Ag/AgCl, 3M KCl) a platinový drátek jako pomocná elektroda. Získaná data byla upravena matematickou korekcí podle algoritmů navržených Savitzkym a Golayem implementovaných do GPES softwaru (EcoChemie). Experimenty byly prováděny při laboratorní teplotě. Jako základní elektrolyt jsme použili borátový pufr pH 7,6 (0,05 mM Na2B4O7 + 0,1 M H3BO3). Parametry měření: rozpouštěcí proud –1 µA, doba akumulace 120 s, kondiční potenciál –0,1 V.
Průtoková analýza (FIA-ED)
FIA-ED systém byl složen ze dvou chromatografických pump (Model 582, ESA, USA), 1 m dlouhé reakční smyčky a osmikanálového CoulArray elektrochemického detektoru (Model 5600A, ESA, USA). Detektor je složen z průtočné analytické komůrky (Model 6210, ESA, USA) obsahující referenční, pomocnou (Pd) a osm porézních grafitových elektrod. Čištění povrchu elektrod od produktů elektrolýzy bylo prováděno elektrochemicky vkládáním pozitivních potenciálu na všechny elektrody (1 V) za vyššího průtoku mobilní fáze (1 ml/min). V samostatném modulu je uložena reakční smyčka, elektrochemický detektor, prostor je termostatovaný (35°C). mVzorek (5 µl) byl injektován manuálně přes dávkovací ventil.
3. Výsledky a diskuse
Současný vývoj analytických metod využívaných pro stanovení MT byl popsán v souhrnné práci Dabrio, M. et al.. V klinické praxi je nejvíce rozšířená analýza MT pomocí imunologických technik (ELISA, RIA). Metodou ELISA je možné stanovovat kolem 100 ng mMT/100 µl vzorku (Tang et. al. 1999). Vzhledem k problematické přípravě protilátek je snaha vyvíjet metody, které by byly stejně selektivní ke stanovovaným isoformám MT jako je ELISA. Jednou z možností je využití kapalinové chromatografie a nebo kapilární elektroforézy. (Minami et. al. 2002) Podle našich předešlých elektrochemických studií s proteiny (Kizek et. al. 2001; Kizek et. al. 2004; Strouhal et. al. 2003; Trnkova et. al. 2002), předpokládáme, že využití FIA nebo HPLC v kombinaci s elektrochemickou detekcí výrazně zlepší možnosti citlivé detekce MT v biologických vzorcích.
Elektrochemické měření
Elektroanalytické stanovení studovaného analytu má řadu výhod, mezi které zcela jistě patří rychlost, velmi dobrá citlivost, reprodukovatelnost a finanční nenáročnost metody. V našich dřívějších experimentech jsme se zabývali stanovením MT pomocí elektrochemické metody CPSA ve spojení s adsorptivní přenosovou technikou (AdTS) (Kizek et. al. 2001; Strouhal et. al. 2003; Trnkova et. al. 2002). MT byl nejdříve akumulován na pracovní povrch rtuťové elektrody, interferující látky odmyty roztokem pufru a elektroda s adsorbovaným MT je přenesena do základního elektrolytu kde probíhá samotné stanovení (Obr. 3A). Při měření 10 ng MT/ml poskytuje metoda AdTS CPSA velmi dobře vyvinutý a symetrický katalytický signál (Obr. 3A-d). Jak je patrno na obrázku 3B je závislost koncentrace MT na výšce signálu lineární (y = 3276,5x + 172,65; R2 = 0,9939). Cílem této práce bylo stanovení MT v průtokovém systému ve spojení s elektrochemickým detektorem (FIA-ED). Multi-elektrodový elektrochemický detektor obsahuje osm porézních grafitových elektrod zapojených v tandemovém uspořádání a na každou z těchto elektrod je možné vložit konstantní potenciál. V tomto zapojení bylo možné studovat oxidační signály MT. Je známo, že na uhlíkových elektrodách proteiny poskytují oxidační signály. (Dabrio et. al. 2002)
![](/files/abstrakta/2004BOD_44_03.jpg)
![](/files/abstrakta/2004BOD_44_04.jpg)
Vliv celkového průtoku mobilní fáze a koncentrace acetonitrilu
Pomocí FIA-ED bylo provedeno základní studium chování králičího MT-1a na uhlíkových porézních elektrodách elektrochemického detektoru. Protože klasické elektrochemické stanovení vyžaduje přítomnost elektrolytu (Březina and Zuman 1952), testovali jsme vliv poměru acetonitrilu a 0,09% kyseliny trifluorooctové na elektrochemickou odpověď analytu. ACN a TFA jsou často používanou součástí mobilní fáze při HPLC separaci, proto je vhodné testovat jejich vliv na elektrodové děje probíhající na elektrodovém systému detektoru. Získaná závislost poměru acetonitrilu a 0,09% TFA ve FIA mobilní fázi ukazuje maximální odpověď na detektoru při obsahu 11-12% ACN. Negativní vliv vyšší koncentrace acetonitrilu na studovaný signál může být způsoben změnou struktury MT a případným zhoršením elektrochemického chování studované látky (Obr. 4A). Důležitým parametrem pro získání maximální odezvy na elektrochemickém detektoru je celkový průtok mobilní fáze. Testovali jsme průtok mobilní fáze od 0,3 do 1 ml. Maximální odezvy jsme získali při průtoku 0,6 ml/min. Při vyšším průtoku se již proudová odezva snižuje a to pravděpodobně díky omezenému času prekoncentrace molekul MT na povrchu pracovních elektrod. Naproti tomu proudové odezvy zaznamenané v oblasti 0,6 ml/min rychlosti průtoku pravděpodobně souvisí s možností saturace aktivního povrchu elektrody čímž dochází ke zvýšení sledovaného signálu (obr. 4B).
![](/files/abstrakta/2004BOD_44_05.jpg)
Vliv aplikovaného potenciálu na pracovní elektrody
Byl studován vliv aplikovaného potenciálu na pracovní elektrody při již známém průtoku mobilní fáze 0,6 ml/min, vhodném poměru mobilní fáze (12% ACN a 88% 0,09% TFA) a teplotě detektoru 35°C. Pro nalezení vhodného potenciálu oxidace stanovovaného MT byl na grafitové porézní elektrody detektoru vkládán potenciál 80, 180, 280, 380, 480, 580, 680 a 780 mV. Získané elektrochemické signály 100 ng MT/ml na jednotlivých elektrodách detektoru jsou ukázány na obrázku 5A. Z uvedených signálů byla odečtena proudová maxima z nichž byl sestrojen hydrodynamický voltampérogram, který vypovídá o elektrochemickém chování stanovované látky v průtokovém uspořádání (Obr. 5B). Pro měření jednotlivých vzorků se volí potenciál v místě největšího proudového rozdílu a nejmenšího potenciálového rozdílu hydrodynamického voltampérogramu. V našem případě bylo vybráno 780 mV jako nejvhodnější potenciál, který byl vložen na poslední elektrodu detektoru.
![](/files/abstrakta/2004BOD_44_06.jpg)
Stanovení koncentrace MT
Při nastavení všech optimálních parametrů metody jsme sestavili kalibrační křivku pro MT a určili limit detekce FIA-ED stanovení. Závislost plochy píku, osmé elektrody (780 mV) detektoru, na koncentraci MT byla lineární a relativní střední chyba
(R.S.D.) se pohybovala kolem 5% (n = 5). Rovnice kalibrační přímky a hodnota spolehlivosti závislosti elektrochemické odpovědi na koncentraci byla y = 0,55x + 3,04; R2 = 0,9989 (viz. Obr. 6A). Na obrázku 6B je ukázán signál, naměřený na elektrodě s pracovním potenciálem 780 mV, 6 pikomolů mMT v 5 µl nástřiku. Limit detekce metody FIA-ED byl určen jako 280 nM resp. 1,4 pmol/5 µl.
4. Závěr
V této práci byl studován metalothionein, jakožto potenciální možný marker pro celou skupinu nádorových onemocnění, metodou FIA-ED. Pro stanovení bylo využito multi-kanálového CoulArray elektrochemického detektoru. Analytický postup jsme optimalizovali pro dosažení co nejvyšší odezvy za použití mobilní fáze ACN/TFA. Závislost na koncentraci MT byla lineární ma stanovený limit detekce byl 1,4 pmol na 5 µl nástřik.
Literatura
- BŘEZINA, M., and P. ZUMAN, 1952 Polarografie v lékařství,
biochemii a farmacii. SZN, Praha.
- CARDOSO, S. V., H. M. BARBOSA, I. M. CANDELLORI, A. M. LOYOLA
and C. F. AGUIAR, 2002 Prognostic impact of metallothionein on oral
squamous cell carcinoma. Virchows Arch. 441: 174–178.
- COYLE, P., J. C. PHILCOX, L. C. CAREY and A. M. ROFE, 2002
Metallothionein: The multipurpose protein. Cell. Mol. Life Sci. 59:
627–647.
- DABRIO, M., A. R. RODRÍGUEZ, G. BORDIN, M. J. BEBIANNO, M. DE
LEY et al., 2002 Recent developments in quantification methods for
metallothionein. J. Inorg. Biochem. 88: 123–134.
- DOUGLAS-JONES, A. G., K. W. S. SCHMID, B. BIER and E. AL., 1995
Metallothionein expression in duct carcinoma in situ of the breast.
Hum. Pathol. 26: 217-222.
- JASANI, B., and M. E. ELMES, 1993 Immunohistochemical detection
of metallothionein. Metallobiochemistry Part B: Metallothionein and
relatd molecules. Methods Enzymol. 205: 95-107.
- JASANI, B., and K. W. S. SCHMID, 1997 Significance of
metallothionein overexpression in human tumors.
Histopathology
31: 211-214. - JOSEPH, M. G., D. BANERJEE, W. KOCHA, R. FELD, L. W. STITT et
al., 2001 Metallothionein expression in patients with small cell
carcinoma of the lung. Cancer 92: 836-842.
- KÄ GI, J. H. R., 1993 Overview of metallothionein.
Metallobiochemistry Part B: Metallothionein and related molecules.
Methods Enzymol. 205: 613-626.
- KÄ GI, J. H. R., and Y. KOJIMA, 1987 Biochemistry of
Metallothionein. Experientia. Suppl. 52: 25–61.
- KIZEK, R., L. TRNKOVÁ and E. PALEČEK, 2001 Determination of
metallothionein at the femtomole level by constant current
stripping chronopotentiomentry. Anal. Chem. 73:
4801–4807.
- KIZEK, R., J. VACEK, L. TRNKOVÁ, B. KLEJDUS and L. HAVEL, 2004
Využití katalytických reakci na rtuťové elektrodě pro
elektrochemické stanovení metalothioneinů. Chem. Listy 96:
100.
- KOJIMA, Y., 1991 Definitions and nomenclature of
metallothioneins. Methods Enzymol. 205: 8–10.
- KUO, T., and S. K. LO, 1997 Immunohistochemical metallothionein
expression in thymoma: correlation with histological types and
cellular origin. Histopathology 30: 243-248.
- MINAMI, T., S. ICHIDA and K. KUBO, 2002 Study of
metallothionein using capillary zone electrophoresis. J. Chrom. B
781: 303-311.
- STROUHAL, M., R. KIZEK, J. VACEK, L. TRNKOVÁ and M. NĚMEC, 2003
Electrochemical study of heavy metals and metallothionein in yeast
Yarrowia lipolytica. Bioelectrochem. 60: 29–36.
- TANG, W. F., T. KIDO, W. A. GROSS, K. NOGAWA, E. SABBIONI et
al., 1999 Measurement of cadmium-induced metallothionein in urine
by ELISA and prevention of overestimation due to polymerization. J
Anal Toxicol 23: 153-158.
- TRNKOVÁ, L., R. KIZEK and J. VACEK, 2002 Catalytic signal of
rabbit liver metallothionein on a mercury electrode: combination of
derivative chronopotentiometry with adsorptive transfer stripping.
Bioelectrochem. 56: 57–61.
- VAŠÁK, M., and D. W. HASLER, 2000 Metallothioneins: new
functional and structural insights. Current Optinion in Chem. Biol.
4: 177-183.
- WEINLICH, G., W. BITTERLICH, V. MAYR, P. O. FRITSCH and B.
ZELGER, 2003 Metallothionein-overexpression as a prognostic factor
for progression and survival in melanoma. A prospective study on
520 patients. Brith. J. of Dermatol. 149: 535-541.
Poděkování
Práce na této publikaci byla financována z dlouhodobého záměru Agronomické fakulty MZLU č. 4321 00001, Grantu 525/04/P132 od GA ČR a IGA MZLU 3/2004 a FRVŠ 164/2004.
Datum přednesení příspěvku: 26. 5. 2004