Konference: 2011 XXXV. Brněnské onkologické dny a XXV. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie
Téma: Pokroky v biologii nádorů
Číslo abstraktu: 147
Autoři: Silva Reptová; Ing. Kateřina Trtková, CSc.; prof. MUDr. Zdeněk Kolář, CSc.
Úvod
Androgenový receptor (AR) je jaderný receptor s funkcí ligand-dependentního transkripčního faktoru. Jeho funkce je regulována vazbou androgenů, které iniciují konformační změny receptoru a následnou transkripci na androgenech závislých genů (Gao, et al. 2005). AR má významný vliv na vývoj a funkci normální prostaty a zároveň hraje důležitou roli v progresi karcinomu prostaty (Richter et al., 2007). Ke stimulaci růstu rakoviny vlivem androgenů dochází třemi mechanismy: expresí, aktivací a regulací aktivity AR; ligand-dependentní aktivací AR a mutací v genu pro AR. Aktivace transkripce AR je kódována v N-terminální doméně 1. exonu. V tomto exonu byly identifikovány dvě polymorfní tandemové repetice CAG a méně polymorfní GGC a jeden jednonukleotidový polymorfismus známý jako AR-E211 G>A (rs6152, G1733A), který se projevuje se změnou v nukleotidu G (guanin) na A (adenin) ve třetí pozici kodonu 211 (Esteban, 2005; Hayes, 2005). Distribuce AR-E211 G>A polymorfismu se v různých populacích liší. Frekvence alely A se u Evropanů pohybuje okolo 10% (Esteban, 2005). Sasaki et al. (2004) uvádí, že přítomnost alely A byla zjištěna u různých typů nádorových onemocnění. U karcinomu prostaty se setkáváme s několika tvrzeními o asociaci menšinové alely A a projevem rakoviny. Hayes et al. (2005) zjistili, že u IV. stupně rakoviny je tato varianta méně zastoupena oproti stupňům nižším. Medeiros et al. (2003) naopak tvrdí, že u pacientů s vysokým stupněm tumoru ≥ VII se alela A vyskytuje častěji.
Dalším mechanismem jež ovlivňuje expresi AR je metylace DNA (Nakayama et al., 2000). Při metylaci DNA dochází k navázání metylových skupin na cytosin v pozici 5. K modifikaci dochází nejčastěji u dinukleotidu CpG. Existuje mnoho tzv. CpG ostrůvků v promotorových oblastech genů, jež jsou normálně nemetylovány (Issa, 2005). U metastatických karcinomů prostaty bylo zjištěno, že metylace v několika shodných sekvencí promotoru AR jsou spojovány se ztrátou exprese AR (Kinoshita et al., 2000).
Naším cílem bylo zjistit distribuci obou alel SNP AR-E211 G>A v souboru pacientů s karcinomem prostaty (CaP) a benigní prostatickou hyperplazií (BPH). U pacientů po RRP (radikální retropubické prostatektomii) ověřit, zda-li polymorfismus detekovaný v DNA z krevních vzorků koreluje s polymorfismem DNA nádorové a nenádorové prostatické tkáně a u těchto pacientů současně provést metylační analýzu CpG úseku lokalizovaného v 1. exonu AR.
Materiál a metodika
Krevní vzorky od 295 pacientů s CaP a BPH sloužily jako templát pro přímou analýzu kitem Phusion Blood® Direct PCR (Finnzymes) na přístroji Piko™ Thermal Cycler (Finnzymes). Produkty PCR byly štěpeny restrikční endonukleázou StuI při 37°C po dobu 1 hodiny. Alela G byla určována na základě přítomností dvou 329 bp a 87 bp štěpných produktů, zatímco neštěpený 416 bp PCR produkt odpovídá alele A.
Ze sledovaného souboru bylo vybráno 10 pacientů po RRP (5 pacientů s alelou A a 5 pacientů s alelou G) a od každého z nich byla v řezech z parafinových bloků vybrána oblast prostaty s morfologií BPH a CaP. Tkáňové řezy o celkové ploše 15 µm2 byly rozpouštěny ve 100 µl 1x Phusion HF pufru (Finnzymes) a s proteinázou K (Gentra) inkubovány při 60°C přes noc. Pro PCR byl použit 1 µl z rozpuštěné tkáňové suspenze a pomocí Phusion High-Fidelity DNA polymerázy (Finnzymes) bylo amplifikováno 100 bp produkt PCR. Součástí tohoto produktu bylo stejné restrikční místo StuI jako u 416 bp PCR produktu amplifikovaného z krevních vzorků. Detekce 46 bp a 54 bp štěpných produktů ve 3% agarosovém gelu byla použita pro průkaz přítomnost alely G, neštěpící se 100 bp PCR produkt pak pro průkaz alely A.
Bisulfitová DNA byla izolována pomocí kitu Epitect® Plus Bisulfite (Qiagen) a pro detekci metylací byly navrženy primery specifické pro metylovanou DNA po bisulfitové modifikaci (60 bp PCR produkt), primery amplifikující nemetylovanou bisulfitovou DNA (64 bp produkt) a primery, které tentýž úsek amplifikují v případě, že bisulfitová modifikace DNA nebyla účinná. Kromě negativních kontrol u metylovaných a nemetylovaných párů primerů jsme pro PCR analýzu používali kontrolní metylovanou DNA (Chemicon).
Výsledky a závěr
Z celkového souboru krevních vzorků od 295 pacientů s CaP a BPH se alela A vyskytovala v 15,3% a alela G v 84,7%. Z vybraných 10 pacientů po RRP jsme prokázali absolutní shodu SNP v nádorové i nenádorové tkáni u 4 pacientů s alelou A. U zbývajících 6 pacientů jsme detekovali v nádorové tkáni buď alelou druhou nebo alely obě. Výsledky naznačují větší shodu mezi krevním a tkáňovým polymorfismem u tkáně nenádorové než u tkáně nádorové.
Nezjistili jsme vztah mezi přítomností obou alel a metylačními změnami. Nejen všechny nádorové, ale i nenádorové vzorky tkáně vykazují metylace ve sledovaném úseku 1. exonu AR.
Literatura:
Práce byla financována granty IGA NS/9940-4/2008, IGA NS10262-3/2009 a podpořena MSM 6198959216.
Androgenový receptor (AR) je jaderný receptor s funkcí ligand-dependentního transkripčního faktoru. Jeho funkce je regulována vazbou androgenů, které iniciují konformační změny receptoru a následnou transkripci na androgenech závislých genů (Gao, et al. 2005). AR má významný vliv na vývoj a funkci normální prostaty a zároveň hraje důležitou roli v progresi karcinomu prostaty (Richter et al., 2007). Ke stimulaci růstu rakoviny vlivem androgenů dochází třemi mechanismy: expresí, aktivací a regulací aktivity AR; ligand-dependentní aktivací AR a mutací v genu pro AR. Aktivace transkripce AR je kódována v N-terminální doméně 1. exonu. V tomto exonu byly identifikovány dvě polymorfní tandemové repetice CAG a méně polymorfní GGC a jeden jednonukleotidový polymorfismus známý jako AR-E211 G>A (rs6152, G1733A), který se projevuje se změnou v nukleotidu G (guanin) na A (adenin) ve třetí pozici kodonu 211 (Esteban, 2005; Hayes, 2005). Distribuce AR-E211 G>A polymorfismu se v různých populacích liší. Frekvence alely A se u Evropanů pohybuje okolo 10% (Esteban, 2005). Sasaki et al. (2004) uvádí, že přítomnost alely A byla zjištěna u různých typů nádorových onemocnění. U karcinomu prostaty se setkáváme s několika tvrzeními o asociaci menšinové alely A a projevem rakoviny. Hayes et al. (2005) zjistili, že u IV. stupně rakoviny je tato varianta méně zastoupena oproti stupňům nižším. Medeiros et al. (2003) naopak tvrdí, že u pacientů s vysokým stupněm tumoru ≥ VII se alela A vyskytuje častěji.
Dalším mechanismem jež ovlivňuje expresi AR je metylace DNA (Nakayama et al., 2000). Při metylaci DNA dochází k navázání metylových skupin na cytosin v pozici 5. K modifikaci dochází nejčastěji u dinukleotidu CpG. Existuje mnoho tzv. CpG ostrůvků v promotorových oblastech genů, jež jsou normálně nemetylovány (Issa, 2005). U metastatických karcinomů prostaty bylo zjištěno, že metylace v několika shodných sekvencí promotoru AR jsou spojovány se ztrátou exprese AR (Kinoshita et al., 2000).
Naším cílem bylo zjistit distribuci obou alel SNP AR-E211 G>A v souboru pacientů s karcinomem prostaty (CaP) a benigní prostatickou hyperplazií (BPH). U pacientů po RRP (radikální retropubické prostatektomii) ověřit, zda-li polymorfismus detekovaný v DNA z krevních vzorků koreluje s polymorfismem DNA nádorové a nenádorové prostatické tkáně a u těchto pacientů současně provést metylační analýzu CpG úseku lokalizovaného v 1. exonu AR.
Materiál a metodika
Krevní vzorky od 295 pacientů s CaP a BPH sloužily jako templát pro přímou analýzu kitem Phusion Blood® Direct PCR (Finnzymes) na přístroji Piko™ Thermal Cycler (Finnzymes). Produkty PCR byly štěpeny restrikční endonukleázou StuI při 37°C po dobu 1 hodiny. Alela G byla určována na základě přítomností dvou 329 bp a 87 bp štěpných produktů, zatímco neštěpený 416 bp PCR produkt odpovídá alele A.
Ze sledovaného souboru bylo vybráno 10 pacientů po RRP (5 pacientů s alelou A a 5 pacientů s alelou G) a od každého z nich byla v řezech z parafinových bloků vybrána oblast prostaty s morfologií BPH a CaP. Tkáňové řezy o celkové ploše 15 µm2 byly rozpouštěny ve 100 µl 1x Phusion HF pufru (Finnzymes) a s proteinázou K (Gentra) inkubovány při 60°C přes noc. Pro PCR byl použit 1 µl z rozpuštěné tkáňové suspenze a pomocí Phusion High-Fidelity DNA polymerázy (Finnzymes) bylo amplifikováno 100 bp produkt PCR. Součástí tohoto produktu bylo stejné restrikční místo StuI jako u 416 bp PCR produktu amplifikovaného z krevních vzorků. Detekce 46 bp a 54 bp štěpných produktů ve 3% agarosovém gelu byla použita pro průkaz přítomnost alely G, neštěpící se 100 bp PCR produkt pak pro průkaz alely A.
Bisulfitová DNA byla izolována pomocí kitu Epitect® Plus Bisulfite (Qiagen) a pro detekci metylací byly navrženy primery specifické pro metylovanou DNA po bisulfitové modifikaci (60 bp PCR produkt), primery amplifikující nemetylovanou bisulfitovou DNA (64 bp produkt) a primery, které tentýž úsek amplifikují v případě, že bisulfitová modifikace DNA nebyla účinná. Kromě negativních kontrol u metylovaných a nemetylovaných párů primerů jsme pro PCR analýzu používali kontrolní metylovanou DNA (Chemicon).
Výsledky a závěr
Z celkového souboru krevních vzorků od 295 pacientů s CaP a BPH se alela A vyskytovala v 15,3% a alela G v 84,7%. Z vybraných 10 pacientů po RRP jsme prokázali absolutní shodu SNP v nádorové i nenádorové tkáni u 4 pacientů s alelou A. U zbývajících 6 pacientů jsme detekovali v nádorové tkáni buď alelou druhou nebo alely obě. Výsledky naznačují větší shodu mezi krevním a tkáňovým polymorfismem u tkáně nenádorové než u tkáně nádorové.
Nezjistili jsme vztah mezi přítomností obou alel a metylačními změnami. Nejen všechny nádorové, ale i nenádorové vzorky tkáně vykazují metylace ve sledovaném úseku 1. exonu AR.
Literatura:
- Esteban, E., Via, M., González-Pérez, E., Santamaría, J.,
Dugoujon, J.M., Vona, G., Harich, N., Luna, F., Saetta, A. A.,
Bissar, N., Moral, P. (2005): An unexpected wide population
variation of the G1733A polymorphism of the androgen receptor gene:
Data on the Mediterranean region. American Journal of Human Biology
17: 690-695.
- Gao, W., Bohl, C.E., Dalton, J.T. (2005): Chemistry and
structural biology of androgen receptor. Chem Rev. 105 (9):
3352-
3370. - Hayes, V.M., Severi, G., Eggleton, S. A., Padilla, E. J. D.,
Southey, M. C., Sutherland, R.L., Hopper, J.L., Giles, G.G. (2005):
The E211 G>A androgen receptor polymorphism is associated with a
decreased risk of metastatic prostate cancer and androgenetic
alopecia. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention 14 (4):
993-996.
- Issa, J.P. (2004): CpG island methylator phenotype in cancer.
Nature Reviews Cancer 4: 988-993.
- Kinoshita, H., Shi, Z., Sandefur, C., Meisner, L. F., Chang,
CH., Choon, A., Reznikoff, C.R., Bova, G.S., Friedl, A., Jarrard,
D.F. (2000): Methylation of the androgen receptor minimal promoter
silences transcription in human prostate cancer. Cancer Research
60: 3623-3630.
- Medeiros, R., Vasconcelos, A., Costa, S., Pinto, D., Morais,
A., Oliveira, J., Lopees, C. (2003): Steroid hormone
genotypes
ARStuI and ER325 are linked to the progression of human prostate cancer. Cancer Genetics and Cytogenetics 141: 91-96. - Nakayama, T., Watanabe, M., Suzuki, H., Toyota, M., Sekita, N.,
Hirokawa, Y., Mizokami, A., Ito, H., Yatani, R., Shiraishi, T.
(2000): Epigenetic regulation of androgen receptor gene expression
in human prostate cancer. Laboratory Investigation 80:
1789-1796.
- Richter, E., Srivastava, S., Dobi, A. (2007): Androgen receptor
and prostate cancer. Prostate Cancer and Prostatic Diseases
10: 114-118. - Sasaki, M., Nomoto, M., Yonezawa, S., Nakagawa, M., Sakuragi, N., Fujimoto, S., Carroll, P.R., Dahiya, R. (2004): Distribution of a single nucleotide polymorphism in codon 211 of the androgen receptor gene and its correlation with human renal cell cancer in Japanese patients. Biochemical and Biophysical Research Communications 321: 468-471.
Práce byla financována granty IGA NS/9940-4/2008, IGA NS10262-3/2009 a podpořena MSM 6198959216.
Datum přednesení příspěvku: 22. 4. 2011
