ANALÝZA GENŮ REGULUJÍCÍCH APOPTÓZU U ZINEK REZISTENTNÍCH BUNĚČNÝCH LINIÍ

Konference: 2013 XXXVII. Brněnské onkologické dny a XXVII. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky

Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie

Téma: XXVII. Základní a aplikovaný výzkum v onkologii

Číslo abstraktu: 274

Autoři: Bc. Monika Holubová; Bc. Martina Axmanová; MUDr. Jaromír Gumulec; RNDr. Jan Balvan; Markéta Sztalmachová; Mgr. Martina Raudenská, Ph.D.; doc.Ing. René Kizek, Ph.D.; doc.RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D.; RNDr. Michal Masařík, Ph.D.

Východiska:

Orgánově či nádorově specifické pochody regu­lace apoptózy nejsou zcela pochopeny. Právě porozumění spe­cifickým poruchám regulace u jednotlivých typů nádorů může výrazně přispět takováto onemocnění úspěšně a cíleně léčit. Jen částečně objasněnou oblastí je i zinkem modulovaná apoptóza u karcinomu prostaty. Zinečnaté ionty jsou nejen struk turální komponentou, ale působí jako regulační substance řady kaskád včetně apoptických.

 

Obr. 1. Tyto grafy znázorňují relativní expresi významných genů u buněčných linií PC-3 a PNT1A. Jako kontrola byla použita ex­prese těchtogenů u linie PNT1A pěstované v nulové koncent­raci zinečnatých iontů. Na obrázku jsou patrné rozdílné trendy u obou linií v expresi genu pro Bax a naopak shodné reakce na treatment v expresi genu Bcl-2. Gen pro p53 byl významně ovlivněn pouze u linie PNT1A, zatímco rozdílnou expresí genu MT2A reagovala více linie PC-3.

Právě progrese tohoto nádorového onemocnění je spojena s dys-balancí intracelulárních zinečnatých iontů. V našich dřívějších studiích jsme prokázali zapojení těchto iontů do tzv. vnitřní apoptické kaskády; zinečnaté ionty působí proapopticky zvýšením poměru mRNA BAX/Bcl-2. Na toto bylo navázáno vytvořením zinek rezistentních buněčných linií odvozených z nádorových i nenádorových buněk prostaty. Cílem bylo namodelovat karcinom prostaty s metabolizmem zinečnatých iontů podobným jako u nenádorových prostatických buněk. Na tomto modelu byly dále popsány změny v expresi genů spojených s apoptózou, invazivitou a rezistencí k zinku.

Materiál a metody:

V expe­rimentu byly použity linie PC-3 (kostní metastáza) a PNT1A (zdravá tkáň). Buňky byly kultivovány v odpovídajícím médiu s postupně se zvyšující koncentrací zinečnatých iontů (přídavek Zn2SO4). Po dosažení požadované koncentrace byly sklizeny. Následně byla vyizolována RNA, proveden přepis do cDNA a pomocí RealTime-PCR byla stanovena relativní exprese vybraných genů. Vyhodnocení bylo provedeno metodou ddCt. Výsledky byly hodnoceny v SW Statistica 10 za užití obecných regresních modelů a hierarchické shlukové analýzy, hladina p < 0,05 byla považována za signifikantní.

Výsledky:

Použité linie byly viabilní i v koncentracích zinku vysoce převyšujících jejich běžnou IC50. Po porovnání exprese byly zjištěny signifikantní rozdíly v expresi významných regulačních genů mezi standardními liniemi a liniemi zinek rezistentními i mezi jednotlivými treatmenty. Statistický rozdíl mezi liniemi byl prokázán u genu p53 (exprese nižší u nádorové linie, p = 0,001) nebo u MT2A (vyšší u nádorové linie, p = 0,04). Signifikantní trend v závislosti na koncentraci byl popsán u Bcl-2 (linie PNT1A, r = -0,99, p = 0,001) a u FOS (linie PC-3, r = -0,98, p = 0,037), u obou snižující se v závislosti na koncentraci. Vybrané výsledky znázorňuje obr. 1.

Závěr:

Tyto výsledky naznačují, že vlivem zinečnatých iontů skutečně dochází k ovlivnění významných regulačních drah uvnitř buňky, jako je apoptóza, buněčné dělení nebo invazivita.

Práce byla podpořena grantovým projektem MUNI/C/0965/2012.

Datum přednesení příspěvku: 18. 4. 2013