Apoptotický a proliferační expresní profil u nádorových prostatických buněk.

*) Korespondenční autor: masarik@med.muni.cz


Klíčová slova: nádorová onemocnění, p53, NF-κB, prostate

Úvod

Experimenty na nádorových buněčných liniích jsou jedinečným zdrojem opakovatelných informací těžko získatelných z bioptických vzorků. Pro nádory prostaty je typická genetická nestabilita zejména v genech ras a p53, očekává se tak významné narušení následných kaskád a tím proliferační, resp. apoptotické rovnováhy. Cílem práce je popsat hladinu mRNA, genů, které jsou mutovány, nebo up, resp. downregulovány důsledkem porušené regulační kaskády těchto genů – p53, podjednotka p150 NFκB a protoonkogeny c-FOS a c-JUN.

Pro špatně diferencované formy s invazivním růstem a tendencí metastazovat je typické zvýšení exprese genů ras.(Webber, et al.) Důsledkem toho dochází k up-regulaci proliferační kaskády Ras-Raf-MEK-Erk.(Gioeli). U androgen-nezávislých forem nádorů prostaty je popsána role protoonkogenů c-Fos a c-Jun; komplex těchto protoonkogenů aktivuje nezávisle na přítomnosti androgenů geny regulované androgeny a mimoto, c-Jun samostatně funguje jako kofaktor androgenního receptoru.(Edwards, et al.) Tumor-supresorový protein p53 ovlivňuje proliferaci, opravu DNA, apoptózu a odezvu buněk na růstové faktory. Je mutován často u karcinomů prostaty.(Chi, et al.) NF-κB zajišťuje ochranu buněk před apoptózou aktivací antiapoptotických genů a protoonkogenů Bcl-2, c-myc a TRAF-1. U karcinomu prostaty je důsledkem odchylného metabolismu zinečnatých iontů, zinkových transportérů a metalothioneinu očekávaná změněná exprese tohoto signálního genu (Eckschlager, et al., Formigare, et al., Krizkova, et al.). Hladina zinečnatých iontů je u karcinomu snížena zejména v důsledku snížení hladiny zinkového transportéru ZIP-1, prostřednictvím ‘Ras responsive element binding protein-1´ (RREB-1). (Milon, et al.) RREB-1 je aktivován kaskádou RASRAF-MEK-ERK (Thiagalingam, et al.)

Nádory prostaty byly zkoumány zejména na buněčných liniích LNCaP (androgen-senzitivní), PC-3 (androgen-rezistentní) a DU 145 (androgen-rezistentní). Tyto linie nejsou ideálním modelem a mohou se od in vivo stavu výrazně lišit. Jsou odvozeny z metastatického rozsevu v kostech (PC-3), mozku (DU 145) a lymfatických uzlin a nikoli z primárního ložiska.

Buněčná linie 22Rv1 reprezentuje primární prostatický špatně diferencovaný adenokarcinom o Gleason skóre 9. Linie exprimuje androgenní receptor (AR) a syntetizuje PSA. (Sramkoski, et al.). Linie 22Rv1 je vhodnějším modelem prostatického karcinomu také proto, že vykazuje oproti ostatním liniím výrazně nižší stupeň genové variability a nižší stupeň aneuploidie – karyotyp 50 XY (trizomie 7,8,12) – DNA index 1,30 (vedle toho PC-3 1,84 a LNCaP 2,09) (Sramkoski, et al.).

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Materiál a metody

V této studii byly použity dvě buněčné linie: (a) kontrolní, PNT1A, lidská buněčná linie získaná imortalizací normálních prostatických epiteliálních buněk 35letého muže post mortem. Tato linie byla použita jako referenční, relativní exprese genů je vyjádřena vůči této linii. (b) 22Rv1 buněčná linie získaná z xenograftu CWR22 opakovaně pasážovaného na kastrovaných myších odvozeného od promárního androgen-dependentního karcnimou prostaty o Gleason skóre 9 od pacienta s metastázami.

RNA byla izolována pomocí High pure total RNA isolation kitu Roche (Basel, CH). Izolace RNA byla provedena dle instrukcí výrobce. Izolovaná RNA byla použita na syntézu cDNA. RNA byla přepsána pomocí Transcriptor first strand cDNA synthesis kitu Roche (Basel, CH) dle pokynů výrobce. RT-PCR byla provedena v tetraplikátech, pomocí TaqMan 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems). amplifikovaná DNA byla analyzována komparativní Ct metodou, exprese byly standardizovány vůči β-aktinu.

Výsledky a diskuse

Relativní exprese je vyjádřena vůči kontrolní linii PNT1A, reprezentující zdravou prostatickou tkáň. Hodnoda 1,00, resp.100% vyjadřuje žádnou změnu exprese, kladné hodnoty, resp. > 100% vyjadřují relativní zvýšení exprese v násobcích a hodnoty < 1,0 vyjadřují snížení exprese v podílech hodnoty u kontrolní linie.

Hladina všech sledovaných genů je statisticky zvýšena (p < 0,05). K nejvýznamnější změně exprese mezi sledovanými proteiny patří gen NF-κB. Jeho hladina je oproti kontrolní linii snížena na méně než 1/10 – viz Error! Reference source not found.). To je zřejmě důsledkem změněných hladin zinečnatých iontů, které prostřednictvím NF-κB působí proapoptoticky. (Golovine, et al.) Taktéž hladina protoonkogenů c-FOS a c-JUN je snížena oproti kontrole. To je zřejmě důsledkem schopnosti linie syntetizovat AR. Hladina p53 se oproti kontrole nemění.

Závěr

Z výsledků je nejvýznamnější snížení exprese NF-κB. Vzhledem k tomu, že existuje úzký vztah mezi zinečnatými ionty, jejichž hladina je u karcinomu prostaty výrazně snížena, a NF-κB, prostřednictvím níž působí zinečnaté ionty proapoptoticky, je žádoucí dále zkoumat procesy ovlivňující hladinu zinečnatých iontů, další důsledky down-regulace NF-κB a efekty tohoto jevu.

Literatura:

1. Webber, M. M., et al., (1997): Immortalized and tumorigenic adult human prostatic epithelial cell lines: Characteristics and applications. 3. Oncogenes, suppressor genes, and applications, Prostate, 30: 136-142.
2. Gioeli, D., (2005): Signal transduction in prostate cancer progression, Clinical Science, 108: 293-308.
3. Edwards, J., et al., (2004): The role of c-Jun and c-Fos expression in androgen-independent prostate cancer, Journal of Pathology, 204: 153-158.
4. Chi, S. G., et al., (1994): P53 IN PROSTATE-CANCER FREQUENT EXPRESSED TRANSITION MUTATIONS, Journal of the National Cancer Institute, 86: 926-933.
5. Eckschlager, T., et al., (2009): Metallothioneins and Cancer, Curr. Protein Pept. Sci., 10: 360-375.
6. Formigare, A., et al., (2007): Zinc, antioxidant systems and metallothionein in metal mediated-apoptosis: Biochemical and cytochemical aspects, Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology & Pharmacology, 146: 443-459.
7. Krizkova, S., et al., (2009): Metallothionein – a promising tool for cancer diagnostics, Bratisl. Med. J., 110: 93-97.
8. Milon, B. C., et al., (2010): Ras Responsive Element Binding Protein-1 (RREB-1) Down-Regulates hZIP1 Expression in Prostate Cancer Cells, Prostate, 70: 288-296.
9. Thiagalingam, A., et al., (1996): RREB-1, a novel zinc finger protein, is involved in the differentiation response to ras in human medullary thyroid carcinomas, Molecular and Cellular Biology, 16: 5335-5345.
10. Sramkoski, R. M., et al., (1999): A new human prostate carcinoma cell line, 22Rv1, In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal, 35: 403-409.
11. Golovine, K., et al., (2008): Depletion of intracellular zinc increases expression of tumorigenic cytokines VEGF, IL-6 and IL-
    8 in prostate cancer cells via NF-kappa B-dependent pathway, Prostate, 68: 1443-1449.

Poděkování: Příspěvek vznikl za podpory GACR 301/09/P436, IGA MZ NS10200-3.