Detekce fúzního transkriptu SYT-SSX1/2 u pacientů se synoviálním sarkomem pomocí reverzní transkriptázové polymerázové řetězové reakce (RT-PCR)

Synoviální sarkom je jeden z nejčastějších nádorů měkkých tkání u dospělých (vedle maligního histiocytomu, liposarkomu a rhabdomyosarkomu), tvoří 5,6% – 10% sarkomů měkkých tkání, histologicky je možno klasifikovat 4 typy: bifázický typ, monofázický fibrózní typ, monofázický epiteliání typ a obtížně diferenciovatelný typ. Z klinického hlediska je s ohledem na věk a pohlaví pacientů prevalence výskytu choroby mezi 15.–40. rokem života, jen zřídka se objevuje u pacientů mladších 10 let a starších 60 let. Poměr postižených mužů a žen je 1,2 :1,0. Nádor je nejčastěji primárně lokalizován v oblasti dolní končetiny (oblast stehna a kolene) – 60%,horní končetiny – 23%,hlava, krk a trup – 15-20%. V případech diseminace nádorových buněk se objevují metastázy v plicích (94%) a v lymfatických uzlinách (21%). Relativně příznivější prognostické faktory jsou věk pod 15 let, nádor menší než 5 cm, bifázický histologický nález, euploidie buněk a distální lokalizace.Synovial sarkom se nejčastěji deteguje pomocí radiografie (CT, MRI), mikroskopie (odlišení jednotlivých typů buněk nádoru: vřetenovité x epiteliální), imunohistochemie (cytokeratin, epiteliální membránový antigen), pomocí ultrastrukturních nálezů epiteliálních a vřetenovitých buněk. Cytogenetické změny jsou charakterizovány reciprokou translokací t(X;18)(q11;Xp11), která vede k fúzi SYT genu nacházejícím se na chromozomu 18q11a nejčastěji jednoho ze dvou blízkých genů SSX1 (Xp11.23) nebo SSX2 (Xp11.21). Fúzní gen SYT/SSX1, případně SYT/SSX2 byl nalezen v 95% případů pacientů se synoviálním sarkomem. Jiné chromosomální aberace byly častěji pozorovány v metastatických tkáních než v primárním nádoru. Metodou komparativní genomové hybridizace (CGH) byl u pacientů s více než dvěma chromozomálními aberacem zjištěn i dřívější výskyt metastáz.
Molekulárně genetickými metodami je možné detegovat chimérický fúzní transkript materiálu chromozomu 18q11 (SYT-gen) a chromozomu Xp11 (SSX1, SSX2, méně často SSX4). Struktury variant chimerického fúzního transkriptu SYT-SSX1/2 ukazuje schéma 1.
Strategie molekulárně-genetického vyšetření spočívá v izolaci RNA z tkáně nádoru, krve nebo kostní dřeně(pro potvrzení diagnózy, případně snad i pro možné sledování účinnosti léčby), reverzní transkripci (RT-PCR, jedná se o přepis informace z RNA do cDNA), detekci fúzního transkriptu SYT/SSX1, 2 (případně jiného z pěti popsaných). Následuje štěpení PCR produktu restrikčními enzymy pro rozlišení fúzního partnera genu SYT. Jinou možností detekce fúzního genu je využití metody PCR v reálném čase (tzv. real-time PCR) nejprve pro přesné určení daného fúzního partnera, v dalším kroku i pro kvantitativní zastoupení fúzního genu ve vyšetřovaném materiálu. Schéma 2 ukazuje sekvenační analýzu fúzního transkriptu SYT/SSX1,2.
Biologická funkce genu SYT a genů SSX:geny SYT,SSX a SYT/SSX kódují jaderné proteiny, jejichž funkce není zatím přesně známa. SYT gen je vyjádřen v časné embryogenezi.Exprese SSX2 genu byla detekována u pacientů s maligním melanomem, u 25-30% pacientů s nádorem prsu a tlustého střeva.Chimérický gen SYT/SSX kóduje protein, kde 8 posledních aminokyselinových zbytků je nahrazeno 78 aminoyselinovými zbytky z C-konce SSX proteinu. SYT-protein má funkci jako ko-aktivátor transkripce, SSX-protein funguje jako ko-represor (Santos, 2002). Protein kódovaný genem SYT/SSX funguje pravděpodobně tak, že C-konec SSX domény přesměruje SYT-aktivační doménu na nový cílový promotor (Thaete 1999).



Bylo identifikováno 5 fúzních partnerů (SSX1-SSX5) genu SYT (Panagopoulos 2001,Terasaki 2001). Nejčastěji (v 61%) se vyskytuje fúzní gen SYT/SSX1 (pacienti s horší prognózou, kratší stádium bez metastáz), méně č asto (v 37%) fúzní gen SYT/SSX2. Ostatní typy fúzních genů byly detekovány ojediněle. Pro první detekci fúzního genu slouží tkáň nádoru, která je ale v mnoha případech zpětně těžko dosažitelná pro molekulárně biologickou detekci fúzního genu. Proto se v posledních letech využívá možnost získat tuto informaci z tkání fixovaných v parafinových bločcích. Problémem zůstává izolace RNA v množství a kvalitě, dostatečné pro další detekci provozního i fúzního genu na molekulární úrovni. Pomocí techniky PCR v reálném čase je možno velmi citlivě detegovat fúzní gen nebo jiný molekulární marker i při velmi malých množstvích vstupní RNA. Metoda PCR v reálném čase využívá pro amplifikaci syntézy malých fragmentů cDNA a je tedy použitelná i v případě RNA izolované z parafinových bločků. Metodu PCR v reálném čase je možné využít jak v případech zamražených tkání, tak i parafínových bločků. Při použití této metody není nutná následná konfirmace získaného výsledku další nezávislou metodou, je tedy eliminován následný Southern blot, případně sekvencování. Tato molekulárně biologická metoda vykazuje vyšší citlivost a důležitým pozitivním faktorem je i její rychlost. Možnost detekce nejen na úrovni kvalitativních změn, ale zejména sledování kvantitativních změn na molekulární úrovni je velmi důležité pro další léčbu pacienta.Bylo popsáno, že metoda PCR v reálném čase umožň uje díky své vysoké citlivosti detekovat fúzní gen SYT/SSX v nádorových buň kách cirkulujících v krvi pacientů (Hashimoto A et al, 2001) v případech výskytu metastáz. Tyto buňky mohou sloužit ke sledování účinku chemoterapie a metoda by mohla být využita pro stanovení prognózy u pacientů se synoviálním sarkomem.
Na našem souboru pacientů s diagnózou synoviálního sarkomu jsme se pokusili zavést metodu detekce fúzního transkriptu SYT/SSX1,2 pomocí RT-PCR, která je schopna zachytit i velmi malé množství nádorových buněk a nálezem fúzního transkriptu potvrdit diagnózu pacienta. Jako vstupní materiál jsme využili RNA, izolovanou z tkáně nádoru, krve,kostní dřeně nebo parafínových bločků. Izolací nativní tkáně nádoru získáme většinou dostatečné množství RNA pro detekci fúzního transkriptu metodou RT-PCR i citlivější metodou, využívající polymerázovou řetězovou reakci v reálném čase. V jiném biologickém materiálu (parafínový bloček, krev) je buněk nádorové tkáně mnohem méně, je proto třeba zvolit tak citlivou metodu detekce PCR produktu, která nám umožní zachytit i přítomnost malého množství nádorových buněk. Detekce fúzních genů SYT/SSX1, případně SYT/SSX2 standartní metodou PCR nebo metodou PCR v reálném čase by měla v budoucnu sloužit k získání informací, které mohou být využity kupřesnění prognózy pacientů s diagnózou synoviálního sarkomu.