DNA metylace u buněčných linií odvozených z nádorů prostaty

Úvod

Metylace DNA je jeden z mechanismů epigenetické kontroly genové exprese, při kterém dochází k napojení metylových skupin na cytosin (C), po kterém následuje guanin (G). Obecně bývá tato sekvence označována jako CpG, kde – p – znamená fosfátovou vazbu mezi oběma nukleotidy. Většina CpG míst je v lidském genomu metylována, kromě CpG míst označovaných jako CpG ostrůvky, které jsou nemetylovány. U nádorových buněk dochází ke změně nemetylovaných CpG ostrůvků na metylované, což je doprovázenou ztrátou genové exprese. Hypermetylace CpG ostrůvků se vyskytuje na 5’ konci regulační oblasti genu (tj. promotor a první exon) a může vést k jeho umlčení – silencing (Baylin and Herman, 2001). Jarrard a kol. (1998) prokázal, že metylační změny v oblasti CpG ostrůvků na 5’ konci mají vliv na ztrátu exprese nebo funkci androgenového receptoru (AR) u buněk odvozených z nádorů prostaty. Metylace androgenového receptoru nebyla zjištěna u normálních buněk prostaty nebo primárního nádoru. Nicméně, ztráta exprese AR může nastat již v počátečním stádiu hormonálně sensitivních nádorů. Zvýšená heterogenita AR a vyšší podíl nádorových buněk bez exprese AR nepříznivě ovlivňuje výsledky hormonální ablační terapie a přežívání pacientů (Prins et al., 1998). Proto metylace AR může reprezentovat fenotyp, který souvisí s vývojem nádorů prostaty nezávislých na androgenech (Kinoshita et al., 2000).

Metylace CpG úseků v regulační oblasti genu, jež má za následek transkripční inaktivaci genu, může být společně s acetylací nebo deacetylací histonů určující pro regulaci genové exprese. Protože je známá souvislost mezi metylací DNA a deacetylací histonů, zabývali jsme se posouzením předpokládaného demetylačního efektu inhibitoru metylací DNA (5-aza-2’-deoxycytidine
– 5-AzA-CdR), ale i jeho vlivu v kombinací s inhibitorem histonových deacetyláz (butyrát sodný – NaB) u DNA izolované z buněčných linií odvozených z nádorů prostaty.

Materiál a metodika

Použili jsme čtyři nádorové linie odvozené z nádorů prostaty lišící se citlivostí k androgenům. Prostatické nádorové linie DU145 a PC3 reprezentují buňky necitlivé k androgenům, přičemž DU145 AR neexprimuji a PC3 mají sníženou expresi AR. Necitlivá je i linie C4-2 odvozená od androgen sensitivní linie LNCaP. Obě tyto linie exprimují funkční AR a neovlivněné buňky těchto linií sloužily v našem sledování jako linie kontrolní. Buňky linií DU145 a PC3 jsme ovlivňovali 0,5 µMa5 µM 5-AzACdR, dále pak kombinacemi s NaB: 1 mM NaB s 0,5 µM 5-AzA-CdR a 5 mM NaB s 0,5 µM 5-AzA-CdR, po dobu 48 hodin a 6 dní. Genomovou DNA jsme izolovali pomocí Wizard Genomic DNA purifikačního kitu (Promega) podle doporučeného postupu. Epitect® Bisulfite Kit (Qiagen) jsme použili pro bisulfitovou modifikaci a pro přečištění DNA pro následující PCR amplifikaci 384 bp úseku v promotorové oblasti genu AR a 235 bp fragmentu v oblasti 1. exonu AR.

Výsledky a závěr

Výsledkem metylační analýzy DNA úseku nacházejícího se v oblasti 1. exonu AR byla detekce metylačních změn u DNA izolované z buněk linie PC3. U zbývajících tří linií je tento úsek nemetylovaný, tedy nezměněný. Po 48 hodinovém ovlivnění buněk linie PC3 výše uvedenými koncentracemi 5-AzA-CdR a jeho kombinacemi s NaB, jsme zjistili výrazný demetylační efekt u 0,5 µM koncentrace 5-AzA-CdR a u kombinace 0,5 µM 5-AzA-CdR s 1 mM NaB. Výsledky rovněž naznačují menši úspěšnost demetylace po ovlivnění buněk 0,5 µM 5-AzA-CdR v kombinaci s 5 mM NaB. Koncentrace 5 µM 5-AzA-CdR se ukázala jako neúčinná.

Změněný metylační vzor byl detekován u DNA fragmentu z oblasti promotoru u buněk linie DU145. U ostatních linií je tento úsek nemetylovaný. Demetylační efekt je zřejmý po 48 hodinovém ovlivnění buněk všemi výše uvedenými koncentracemi 5AzA-CdR a jeho kombinacemi s NaB. Navíc jako účinná se jeví i kombinace 0,5 µM 5-AzA-CdR a 5 mM NaB, u níž demetylační efekt přetrvává i po 6 dnech inkubace.

Detekce DNA metylací v regulační oblasti – promotoru nebo v úseku 1. exonu genu AR u buněk linií neexprimujících nebo sníženě exprimujících AR, tak potvrzuje předpoklad, že metylační změny mohou být příčinami jeho částečné nebo úplné transkripční inaktivace.

Literatura:

1. Baylin, S. B., Herman, J. G., Promoter hypermethylation – can this change alone ever designate true tumor suppressor gene function? J. Natl. Cancer Inst. 2001, 93: 664-665.
   
2. Jarrard, D. F., Kinoshita, H., Shi, Y., Sandefur, C., Hoff, D., Meisner, L. F., Chang, C., Herman, J. G., Isaacs, W. B., Nassif, N., Methylation of the androgen receptor promoter CpG island is associated with loss of androgen receptor expression in prostate cancer cells. Cancer Res.1998, 58: 5310-5314.
   
3. Kinoshita, H., Shi, Y., Sandefur, C., Meisner L. F., Chang C., Choom, A., Reznikoff, C. R., Bova, G. S., Riedl, A., Jarrard D.F., Methylation of the androgen receptor minimal promoter silence transcription in human prostate cancer. Cancer Res. 2000,60: 3623-3630.
   
4. Prins, G. S., Sklarew, R. J., Pertschuk, L.P., Image analysis of androgen receptor immunostaining in prostate cancer accurately predicts response to hormonal therapy. J. Urol.1998, 159: 641-649.

Práce byla financována grantem IGA NR9475-3/2007 a podpořena z MSM 6198959216.