Efekt doxorubicinu a elipticinu na buněčné nádorové linie, růstové charakteristiky.

Konference: 2011 XXXV. Brněnské onkologické dny a XXV. Konference pro sestry a laboranty

Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie

Téma: Postery

Číslo abstraktu: 236p

Autoři: RNDr. Michal Masařík, Ph.D.; MVDr. Jan Hraběta; Markéta Sztalmachová; MUDr. Jaromír Gumulec; Mgr. Marián Hlavna; RNDr. Jitka Poljaková; prof. RNDr. Marie Stiborová, DrSc.; prof. MUDr. Tomáš Eckschlager, CSc.; MUDr. Monika Masaříková; doc.Ing. René Kizek, Ph.D.

Klíčová slova: doxorubicin, elipticin, nádorové buněčné linie, neuroblastom, monitorování buněk v reálném čase, XCELLigence, MTT

Úvod

Doxorubicin a elipticin patří v současné době mezi často používaná protinádorová léčiva. Doxorubicin je antracyklinové antibiotikum, které je strukturně podobné daunomycinu a jako ostatní antracykliny pracuje na principu interkalace do DNA. Doxorubicin je používán jako léčivo pro široké spektrum nádorových onemocnění počínaje hematologickými malignitami konče sarkomy měkkých tkání (Poljakova, et al.).

Podobně jako doxorubicin i elipticin a některé jeho deriváty, které patřící mezi alkaloidy čeledi Apocyanacae, vykazují významnou protinádorovou aktivitu. Elipticin samotný, nebo jeho deriváty jsou v současné době užívány zejména k léčení pokročilého karcinomu prsu s kostními metastázami, akutní myeloblastické leukémie sarkomů ledvin a karcinomu štítné žlázy (Poljakova, et al.). Důvod proč se elipticin využívá jako protinádorové léčivo je v zásadě dvojí. Jednak působí velmi toxicky na nádorové buňky a druhým důvodem jsou jeho relativně nízké vedlejší toxicické účinky (Poljakova, et al.). Mechanismus účinku elipticinů není ještě přesně popsán. Předpokládá se ale, že převládající mechanismus účinku bude interkalace (podobně jako doxorubicin) do dvoušroubovicové struktury DNA, která vyplývá z velikosti a tvaru molekuly elipticinu a jeho působení jako inhibitor topoisomerázy II (Stiborova, et al., Stiborova, et al.).

Podstatou základního, ale i aplikovaného výzkumu je studium a sledování procesů na různých úrovních od DNA až po proteom event. metabolom. K tomuto slouží celá řada technologií, které se v posledních letech vyvinuly. Tyto zahrnují klasickou PCR, dále PCR v reálném čase ale např. i čipové technologie. Důsledkem tohoto vývoje je ale zjištění, že pouhým zkoumáním DNA a RNA nemůžeme v biologických vědách nabídnout zcela komplexní a uspokojivý pohled. Proto se zaměřujeme i na procesy odehrávající se na úrovni samotných buněk jako je buněčná adheze, proliferace, změna cytoskeletu nebo buněčná smrt (Vondrackova, et al.).

Tato práce se zabývá analýzou toxicity doxorubicinu a elipticinu vzhledem k nádorovým buněčným liniím jednak klasickými metodami, jako je MTT test a dále analýzou buněčné proliferace v reálném čase pomocí přístroje xCELLigence.

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Materiál a metody

Neuroblastomové buněčné linie UKF-NB-3 a UKF-NB-4 odvozené z metastáz v kostní dřeni byly získány od Prof. J. Cinatl Jr. (J. W.Goethe University, Frankfurt, Německo). Buněčná linie UKF-NB-4 byla vytvořena z chemorezistentních nádorových buněk. Neuroblastomová buněčná linie IMR-32 byla zakoupena z LGC Promochem (Wesel, Německo). Buňky byly kultivovány při 37 °C a 5% CO2 v IMDM (Iscove’s modified Dulbecco’s medium) s 10% fetálním telecím sérem, 2 mM glutaminem, 100 jednotkami penicilinu a 100 µg/ml streptomycinu (PAA Laboratories, Rakousko).

Cytotoxicita doxorubicinu a elipticinu byla sledována pomocí klasického MTT testu v 96 jamkovém uspořádání. Počet buněk na jamku byl 10 000. Roztok elipticinu a doxorubicinu v DMSO byl přidán v koncentračním rozmezí 0.02 – 50 µM. Po inkubaci 2-4 dny při 37 °C a v 5% CO2, bylo přidáno MTT a po 4 hodinách byla pomocí ELISA readeru sledována tvorba formazanu při vlnové délce 570 nm. Absorbance kontrolních buněk (bez přidaného cytostatika) byla brána jako 100% viabilita a hodnoty léčených buněk byly stanoveny jako procenta z absorbance kontrolních buněk. Hodnoty inhibiční koncentrace IC50 byly stanoveny lineární regresí softwarem SOFTmaxPro.

Analýza buněk v reálném čase byla prováděna na přístroji xCELLigence (Acea Biosciences Inc., San Diego, USA). Počet buněk na jednu jamku byl 10 000. Koncentrace elipticinu resp. Doxorubicinu byla v koncentračním rozmezí 0.02 – 50 µM a po přidání těchto látek byl sledován buněčný index po dobu 100 hodin. Po ukončení experimentu byla stanovena inhibiční koncentrace IC50.

Výsledky a diskuse

U neuroblastomových buněčných linií byla sledována cytotoxicita elipticinu a doxorubicinu pomocí MTT testu a sledování buněčného indexu přístrojem xCELLigence v reálném čase. Podstatou tohoto systému je sledování buněk rostoucích v tzv. E-plates – mikrotitrační destičky, kde každá jamka má na dně umístěné zlaté mikroelektrody. Princip experimentu je založen na monitorování buněk přisedlých na dno jamek. Detekce je potom založená na měření impedance na dně jamky. Čím silněji buňky adherují nebo čím je více buněk přisedlých na dně jamky, tím větší imedanci vyvolají. Míra impedance je pak vyjádřena v bezrozměrných jednotkách tzv. buněčného indexu (Vondrackova, et al.).

Nejprve jsme stanovili efekt elipticinu rsp. doxorubicinu na růst lidských neuroblastomových buněčných linií (IMR-32, UKFNB-3 a UKF-NB-4) kultivovaných po dobu 96 hodin v přítomnosti elipticinu resp. doxorubicinu. Všechny tři buněčné linie jsou senzitivní vůči elipticinu. Cytotoxicita elipticinu byla srovnána s doxorubicinem, což je jedno z léčiv, které se v současné době používá pro léčbu neuroblastomu. Oba typy cytostatik, jak elipticin tak i doxorubicin, inhibovali růst neuroblastomových buněk v závislosti na dávce léčiva. Inhibiční koncentrace IC50 byla stanovena pomocí lineární regrese. Toxicita elipticinu vůči buněčným liniím UKF-NB-3 a UKF-NB-4 byla srovnatelná s toxicitou doxorubicinu na tyto linie. Nicméně u linie IMR-32 byla senzitivita vůči doxorubicinu přibližně 20x větší než u elipticinu viz Tab. 1.



Tabulka 1. Cytotoxicita elipticinu a doxorubicinu na neuroblastomové buněčné linie.

Stejné stanovení jsme provedli i pomocí přístroje xCELLigence. Výše uvedené neuroblastomové buněčné linie jsme kultivovali ve speciálních mikrotitračních destičkách v přítomnosti elipticinu a doxorubicinmu po dobu 96 hodin a sledovali vývoj buněčného indexu v reálném čase. Z naměřených dat jsme poté stanovili inhibiční koncentraci IC50, která je srovnatelná s hodnotami z MTT testů.

Závěr

Stanovení cytotoxicity elipticinu a doxorubicinu na nádorové buněčné linie pomocí monitorování buněčného indexu v reálném čase je použitelné pro zpřesnění stanovení inhibiční koncentrace IC50 a pro sledování buněčné adheze, proliferace, diferenciace a viability.

Literatura:

  1. Poljakova, J., et al., (2008): The comparison of cytotoxicity of the anticancer drugs doxorubicin and elliptcine to human neuroblastoma cells, Interdisciplinary Toxicology, 1: 186-189.
  2. Poljakova, J., et al., (2009): The mechanism of cytotoxicity and DNA adduct formation by the anticancer drug ellipticine in human neuroblastoma cells, Biochemical Pharmacology, 77: 1466-1479.
  3. Poljakova, J., et al., (2007): DNA adduct formation by the anticancer drug ellipticine in human leukemia HL-60 and CCRFCEM cells, Cancer Letters, 252: 270-279.
  4. Stiborova, M., et al., (2001): The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts, Biochemical Pharmacology, 62: 1675-1684.
  5. Stiborova, M., et al., (2001): Targeting of ellipticine drugs on tumor cells, Chemicke Listy, 95: 549-555.
  6. Vondrackova, L., et al., (2010): Gold eletrodes, Labor Aktuell – ROCHE Diagnostics Division, 01/10: 18-20.

Poděkování: Práce byla podporována grantovým výzkumnými projekty:CYTORES, GACR P301/10/0356, GACR 301/09/P436, IGA MZ NS10200-3.

*) Korespondenční autor: kizek@sci.muni.cz

Datum přednesení příspěvku: 21. 4. 2011