Konference: 2008 IV. ročník DDPEO A I. ročník sympózia O cílené biologické léčbě
Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie
Téma: Molekulární podstata účinku protinádorových léčiv
Číslo abstraktu: 004
Autoři: prof. MUDr. Tomáš Eckschlager, CSc.; MVDr. Jan Hraběta; Katarína Figová; RNDr. Jitka Poljaková; MUDr. Jana Hřebačková; MUDr. Šimon Cipro
Úvod.
Hypoxie je v nádorech velmi častým jevem, který se významně podílí na jejich biologickém chování. Hypoxií indukovaný transkripční faktor (HIF), který je hlavním transkripčním faktorem aktivovaným poklesem pO2, je tvořený dvěmi podjednotkami ARNT/ HIF-1ß a hypoxií indukovanou HIF-1alfa s homology HIF-2alfa a HIF-3alfa. HIF-1alfa řídí transkripci řady genů kódujících proteiny ovlivňující angiogenezu, metabolizmus glukózy, proliferaci, přežívání buněk a invazivitu a metastazování. Overexprese HIF-1alfa je spojená s častým selháním protinádorové léčby vyvolaném snížením cytostatiky navozené apoptózy.
Cíle.
Metody.
Použili jsme buněčné linie odvozené od neuroblastomu vysokého stupně rizika UKF-NB-4 a UKF-NB-3 a z nich připravené linie rezistentní k cytostatikům. Na indukci hypoxických podmínek jsme buněčné kultury kultivovali v uzavřeném systému (Hypoxic chamber, Billups-Rothenberg, Inc., USA) s definovanou směsí plynů O2 (1%), CO2 (5%), N2 (94%). Hypoxický fenotyp testovaných buněk jsme ověřovali kontrolou exprese proteinu HIF-1alfa pomocí Western blotu s králičí polyklonální protilátkou (Upstate Biochemicals). IC50 jednotlivých cytostatik jsme vypočítali z výsledků 96jamkových MTT testů proložením nelineární regresní křivky (software GraphPad Prism4). Kinetiku buněčného cyklu jsme měřili průtokovým cytometru (FACSCalibur) po obarvení buněk propidium jodidem. Apoptózu jsme měřili cytometricky jako hypodiploidní peak a rovněž jsme hodnotili morfologii buněk po obarvení fluorescenčním barvivem Hoechst 33342.
Výsledky a diskuze.
U všech testovaných buněčných linií odvozených od NBL byla citlivost k derivátům platiny, doxorubicinu a k ellipticinu nižší v hypoxických podmínkách, výjimkou byla pouze kyselina valproová, kde byla IC50 v normoxii a v hypoxii prakticky totožná. Hypoxií indukovanou chemorezistenci bylo možné omezit chetominem, který inhibuje vazbu HIF s p300. Tato vazba spouští hypoxií indukovanou transkripci. U všech linií se v hypoxii snížilo zastoupení proliferační frakce a v hypoxii byla nižší i spontánní i cytostatiky indukovaná apoptóza.
Naše studie potvrzuje, že hypoxie vyvolává chemorezistenci nádorových buněk. Protože hypoxie v nádorech je častá, je testování nových látek s protinádorovými účinky nezbytné i v hypoxii.
Práce vznikla za finanční podpory IGA grant NR9522-3, MŠMT grant MSM0021620813 a GAUK grant 72208/2008.
Hypoxie je v nádorech velmi častým jevem, který se významně podílí na jejich biologickém chování. Hypoxií indukovaný transkripční faktor (HIF), který je hlavním transkripčním faktorem aktivovaným poklesem pO2, je tvořený dvěmi podjednotkami ARNT/ HIF-1ß a hypoxií indukovanou HIF-1alfa s homology HIF-2alfa a HIF-3alfa. HIF-1alfa řídí transkripci řady genů kódujících proteiny ovlivňující angiogenezu, metabolizmus glukózy, proliferaci, přežívání buněk a invazivitu a metastazování. Overexprese HIF-1alfa je spojená s častým selháním protinádorové léčby vyvolaném snížením cytostatiky navozené apoptózy.
Cíle.
- určit vliv hypoxie na citlivost neuroblastomových buněk k cisplatině a karboplatině
- sledovat změny buněčného cyklu a apoptózu v normoxických a hypoxických podmínkách.
Metody.
Použili jsme buněčné linie odvozené od neuroblastomu vysokého stupně rizika UKF-NB-4 a UKF-NB-3 a z nich připravené linie rezistentní k cytostatikům. Na indukci hypoxických podmínek jsme buněčné kultury kultivovali v uzavřeném systému (Hypoxic chamber, Billups-Rothenberg, Inc., USA) s definovanou směsí plynů O2 (1%), CO2 (5%), N2 (94%). Hypoxický fenotyp testovaných buněk jsme ověřovali kontrolou exprese proteinu HIF-1alfa pomocí Western blotu s králičí polyklonální protilátkou (Upstate Biochemicals). IC50 jednotlivých cytostatik jsme vypočítali z výsledků 96jamkových MTT testů proložením nelineární regresní křivky (software GraphPad Prism4). Kinetiku buněčného cyklu jsme měřili průtokovým cytometru (FACSCalibur) po obarvení buněk propidium jodidem. Apoptózu jsme měřili cytometricky jako hypodiploidní peak a rovněž jsme hodnotili morfologii buněk po obarvení fluorescenčním barvivem Hoechst 33342.
Výsledky a diskuze.
U všech testovaných buněčných linií odvozených od NBL byla citlivost k derivátům platiny, doxorubicinu a k ellipticinu nižší v hypoxických podmínkách, výjimkou byla pouze kyselina valproová, kde byla IC50 v normoxii a v hypoxii prakticky totožná. Hypoxií indukovanou chemorezistenci bylo možné omezit chetominem, který inhibuje vazbu HIF s p300. Tato vazba spouští hypoxií indukovanou transkripci. U všech linií se v hypoxii snížilo zastoupení proliferační frakce a v hypoxii byla nižší i spontánní i cytostatiky indukovaná apoptóza.
Naše studie potvrzuje, že hypoxie vyvolává chemorezistenci nádorových buněk. Protože hypoxie v nádorech je častá, je testování nových látek s protinádorovými účinky nezbytné i v hypoxii.
Práce vznikla za finanční podpory IGA grant NR9522-3, MŠMT grant MSM0021620813 a GAUK grant 72208/2008.
Datum přednesení příspěvku: 26. 11. 2008
