Exprese CDI33 a nestinu v buněčných liniích erivovaných z rhabdomyosarkomu.

Úvod

Transmembránový glykoprotein CD133 (označovný též jako prominin-1) byl poprvé popsán v rámci dvou nezávislých studií jako povrchový antigen v populaci CD34+ hematopoetických kmenových buněk, resp. u myších neuroepitheliálních kmenových buněk [1,2]. Ačkoliv jeho biologická funkce není doposud zcela jasná, předpokládá se, že hraje důležitou roli v organizaci plazmatických protruzí, ovlivňuje buněčnou polaritu a interaguje se sousedními buňkami a extracelulární matrix. Pomocí imunodetekce byla jeho glykosylovaná forma prokázána u mnoha typů nádorů.

Nestin je proteinem VI. třídy intermediálních filament (IF) a je u savců za normálních okolností exprimován během vývoje v kmenových a progenitorových buňkách CNS. V dospělém organismu je poté nahrazen jinými proteiny IF. Nicméně za určitých patologických podmínek, mezi které lze řadit i tumorigenezi, dochází k reexpresi nestinu. V současné době byl nestin prokázán v různých typech solidních nádorů.

Jelikož jsou oba výše popsané proteiny řazeny k markerům kmenových buněk a jejich koexprese byla potvrzena nejen u nádorů CNS [3], ale nově i u osteosarkomů [4,5], bylo cílem této studie ověřit jejich expresi u buněčných linií, které byly na našem pracovišti derivovány z rhabdomyosarkomů.

Materiál a metody

Buněčné linie: Studie byla provedena na celkem 5 buněčných liniích - z toho dvě linie jsou derivovány z embryonálního rhabdomyosarkomu (NSTS-10, NSTS-11), jedna linie z alveolárního rhabdomyosarkomu (NSTS-9) a dvě linie z alveolárního rhabdomyosarkomu s embryonální komponentou (NSTS-8, NSTS-12). Věk pacientů se pohyboval v rozmezí 2 až 21 let v době diagnózy.

Primární protilátky: Rabbit polyclonal anti-CD133 antibody (No. ab19898, Abcam), Mouse monoclonal anti-nestin antibody (clone 10C2, Millipore), Rabbit polyclonal isotype control (No. ab37416, Abcam)

Sekundární protilátky: Anti-rabbit IgG antibody FITC conjugate (No. F9887, Sigma), Anti-mouse IgG antibody FITC conju-gate (No. F8521, Sigma), Anti-rabbit IgG antibody TRITC conjugate (No. T6778, Sigma), Anti-mouse IgG antibody peroxidase cojugate (No. A9917, Sigma) a Anti-rabbit IgG antibody peroxidase cojugate (No. A2074, Sigma).

Imunofluorescence: Buněčná suspenze byla nasazena na krycí sklo a 24 h inkubována. Poté byly buňky opláchnuty v PBS, fixovány 3% paraformaldehydem a následně blokovány ve 2 % BSA. Nestin a CD133 byly vizualizovány pomocí nepřímé imunofluorescence a na závěr byl preparát montován do uzavíracího media Vectashield obsahujícího DAPI.

Flow-cytometrie: Buněčná suspenze byla promyta v PBS, fixována 3 % paraformaldehydem a následně značena pomocí nepřímé imunofluorescence. Analýza byla prováděna na BD FACSCantoII (BD Biosciences).

Imunobloting: Proteiny byly rozděleny pomocí elektroforézy na 6 % (nestin) nebo 7 % (CD133) polyakrylamidovém gelu. Poté byly přeneseny na PVDF membránu (Bio-Rad Laboratories), která byla následně blokována 5 % mlékem v PBS-T (0,1 % Tween v PBS). Následovala hybridizace s primárními a sekundárními protilátkami a nakonec ECL-Plus detekce (GE Healthcare).

Výsledky

CD133 i nestin byly pomocí imunofluorescence detekovány ve všech pěti buněčných liniích derivovaných z rhabdomyosarkomu. U linie NSTS-11 bylo pozorováno od 10 do 50 % CD133+ buněk, u linie NSTS-9 přibližně 50 % CD133+ buněk a u linií NSTS-8, NSTS-10 a NSTS-12 více než 50 % CD133+ buněk. Všechny buněčné linie vykazují při značení CD133 střední až silnou intenzitu fluorescence.

U linií NSTS-9, NSTS-10 a NSTS-11 bylo pozorováno přibližně 10 % Nes+ buněk, u linie NSTS-8 méně než 10 % Nes+ buněk a pouze jedno procento Nes+ buněk bylo pozorováno u linie NSTS-12. Fluorescence vykazovaná značeným nestinem se pohybuje v rozmezí střední až nízké intenzity u linií NSTS-8, NSTS-9, NSTS-10 a NSTS-11. U linie NSTS-12 byla tato intezita velmi nízká.

Přítomnost obou sledovaných proteinů ve všech pěti zkoumaných liniích potvrdily i výsledky imunoblotingu.

U linie NSTS-11 bylo flow-cytometrickou analýzou rovněž zjištěno, že exprese CD133 se zvyšuje v závislosti na délce kultivace po dobu nejméně šesti dnů. Od druhého do šestého dne kultivace se hodnota fluorescence zvýšila o 193 %, přičemž při výpočtu jednotlivých hodnot fluorescence byla zohledněna jak nespecifická fluorescence, tak zvětšující se průměrná velikost buněk.

Závěr
V rámci této studie jsme jako vůbec první popsali expresi CD133 u buněk rhabdomyosarkomů. Koexprese CD133 a nestinu u části buněčné populace v jednotlivých liniích by mohla ukazovat na přítomnost buněk s vlastnostmi nádorových kmenových buněk. Potvrzení této hypotézy však bude vyžadovat zkoumání exprese dalších markerů, které jsou s fenotypem nádorových kmenových buněk spojovány. Závislost zvyšující se exprese CD133 na délce kultivace buněčné linie může být způsobena hypooxygenním stresem, což naznačují i práce jiných autorů [6,7]. Dalším možným vysvětlením je postupné ukládání CD133 do vezikul, které již bylo také v literatuře popsáno [4].

Výsledky této studie přinášejí nové poznatky v oblasti výzkumu markerů nádorových kmenových buněk u solidních nádorů dětského věku a mohou být významné nejen z hlediska studia biologických vlastností nádorů, ale i ve vztahu k léčebným strategiím u těchto onemocnění.

Tato studie byla podpořena granty VZMSM 0021622415, IGA MZCR NR/9125-4 2006, GACR 204/08/H054 a MUNI/A/0091/2009.