Exprese polycombních genů Bmi1 a Ezh2 u neuroektodermových nádorů

Úvod
Lidské protoonkogeny Bmi1 a Ezh2 jsou transkripční faktory patřící do rodiny polycombních genů (PcG). Exprese těchto genů je tkáňově specifická a jimi kódované proteinové komplexy jsou zapojeny do regulace embryonálního vývoje, hematopoézy, buněčného cyklu a senescence. Mechanismus jejich účinku spočívá ve vazbě do chromozomální DNA a následné stabilní epigenetické modifikaci cílových genů. Bylo prokázáno, že nepřiměřená exprese či aktivace proteinů Bmi1 či Ezh2 vede k narušení biologické stability a nádorové transformaci buněk.
Protein Bmi1 reguluje proliferaci kmenových buněk hematopoetického a nervového systému prostřednictvím suprese Ink4a/Arf lokusu. Nadměrná exprese Bmi1 indukuje leukémie, naopak deficience Bmi1 vede k řadě hematologických a neurologických abnormalit. Zvýšená exprese Bmi1 je pozorována také u přibližně 25% meduloblastomů s abnormálně aktivovanou Shh signální dráhou, jež řídí proliferaci granulárních prekursorových buněk mozečku.
Protein Ezh2 je histon metyltransferáza regulující geny přechodu G2-M esenciální pro proliferaci jak transformovaných tak netransformovaných buněk. Zvýšená exprese Ezh2 je spojována s invazivním růstem a agresivním chováním nádorů prostaty, mléčné žlázy a endometria. Současné studie označily Ezh2 protein za vhodného kandidáta pro cílenou terapii těchto tumorů.

Cíl studie
Cílem této prioritní imunohistochemické studie bylo stanovit a analyzovat expresi proteinů Bmi1 a Ezh2 na souboru 41 neuroektodermových nádorů různé histogeneze a stupně malignity. Studie byla doplněna experimenty na buněčných liniích gliálních nádorů.

Materiál a metodika
Soubor tvořilo 41 archivních vzorků neuroektodermových nádorů sestavených triplicitně do TMA (Tissue MicroArray). Jednalo se o 9 vzorků „high-grade“ astrocytomů (glioblastom, anaplastický astrocytom), 8 „low-grade“ astrocytomů (fibrilární astrocytom), 2 ependymomy, 2 anaplastické ependymomy, 4 meningiomy, 2 maligní meningiomy, 3 oligodendrogliomy, 2 neurofibromy, 2 kraniofaryngeomy, 2 pineocytomy, 1 vzorek pineoblastomu a meduloblastomu. Soubor byl doplněn 3 vzorky nenádorové mozkové tkáně (v jednom případě však odebrané cíleně z blízkého okolí nádoru). Exprese Bmi1, Ezh2 a nestinu byla stanovena metodou nepřímé imunohistochemie pomocí monoklonálních a polyklonálních protilátek (Tabulka 1).


Výsledný signál byl hodnocen semikvantitativně stanovením H-skóre: součin stupně pozitivních buněk (0 = do 10% pozitivních buněk, 1 = 11-29% pozitivních buněk, 2 = 30-59% pozitivních buněk, 3 = 60% a více pozitivních buněk) a intenzity barvení (0 = negativní, 1 = slabě viditelná intenzita, 2 = středně hnědá intenzita barvení, 3 = sytě hnědá intenzita barvení), maximální hodnota H-skóre je 9. Statistická analýza byla provedena pomocí t-testu. Exprese Bmi1 a Ezh2 byla taktéž sledována Western blot analýzou na gliálních nádorových buněčných liniích U-87MG, T-98G a A172, U118MG.

Výsledky
U souboru „low-grade“ astrocytomů (LGA) bylo v případě Ezh2 zjištěno statisticky signifikantně vyšší H-skóre než u souboru „high-grade“ astrocytomů (HGA) (LGA 3,69; HGA 6,97; p e 0.06). Exprese Bmi1 byla taktéž vyšší u LGA, výsledek však nedosáhl statistické signifikance (LGA 5,69; HGA 7,29; p e 0.164). Naopak exprese nestinu byla signifikantně vyšší u „high-grade“ nádorů (LGA 3,59; HGA 6,88; pe0.043). Obdobný obraz byl zjištěn také při ;porovnání H-skóre ependymomů (BMI-1 = 2; Ezh2 = 9) a anaplastických ependymomů (Bmi1 = 1,38; Ezh2 = 2,25) a při srovnání meningiomů (Bmi1 = 3,93; Ezh2 = 3) a maligních meningiomů (Bmi1 = 1,5; Ezh2 = 4,5). Zvýšená exprese Bmi1 a Ezh2 byla též zjištěna u všech oligodendrogliomů a u meduloblastomu. ?Výsledky u těchto lézí však nedosáhly hladiny významnosti (p e 0,05). Normální tkáň mozku nevykazovala expresi ani jednoho ze studovaných proteinů, tkáň mozku histologicky normálního vzhledu z blízkého okolí nádoru však vykazovala vysokou expresi jak Bmi1 (9) tak Ezh2 (9). Byly též zjištěny rozdíly v expresi Bmi1 a Ezh2 u jednotlivých linií gliálních nádorů. Byla pozorována zvýšená hladina Bmi1 u linií U-87MG (anaplastický astrocytom, wild-type forma p53) a T-98G (multiformní glioblastom, mutovaná forma p53, exprese MRP proteinu); exprese Ezh2 dosahovala nejvyšších hladin u linie U-87MG (anaplastický astrocytom, wild-type forma p53).

Diskuze a závěry
Zvýšená exprese proteinů PcG u „low-grade“ nádorů s příznivější prognózou může odrážet jejich dosud zachovanou schopnost udržet buňky v diferencovaném stavu, což je také podpořeno nálezem pozitivity exprese znaku astrogliální diferenciace – proteinu GFAP. U buněk „high-grade“ nádorů může být schopnost diferencovat již ztracena. Tuto domněnku podporuje nález zvýšené exprese nestinu – markeru neuroektodermových nezralých buněk. Zajímavým nálezem může být zvýšená exprese Bmi1 a Ezh2 ve tkáni blízké nádoru – může reflektovat významné změny v mikroprostředí v okolí nádoru. Vliv PcG proteinů na biologické vlastnosti nádoru podporují též nálezy na buněčných liniích.
Lze shrnout, že výše uvedené prioritní nálezy s největší pravděpodobností ukazují, že kromě nádorů epitelových a mezenchymových jsou také nádory neuroektodermové ovlivňovány proteiny rodiny PcG.

Podpořeno granty MŠM 6198959216, FRVŠ 1722/2006 a IGA MZ ČR NR 8370/03.