Genetická problematika rakoviny plic

Úvod:

Rakovina plic patří celosvětově mezi nejčastější nádorové onemocnění; také v České republice morbidita a mortalita na nádory plic dlouhodobě vzrůstá, v současnosti především u žen. Jakkoli se jedná o onemocnění ponejvíce spojené s kuřáctvím cigaret, genetické faktory mají při jeho vzniku, progresi, terapii a prognóze významnou úlohu.

Genetické faktory se podle klasických odhadů podílejí na vzniku plicní rakoviny nejméně z 10-15%. Týká se to asi 100 000 lidí na celém světě a asi 16 až 20 tisíc úmrtí ročně; v ČR pak kolem 500 mužů a asi 150-200 žen a odhadem asi 430 úmrtí u mužů a 130 úmrtí u žen.

Ve skutečnosti je nádorové bujení nemocí buněčného cyklu, což je obsáhlý komplex navýsost geneticky řízených pochodů, interakce velkého počtu geneticky definovaných molekul. Proto představuje každý nádor soubor celé řady genetických chyb. Doposud bylo u plicní rakoviny popsáno více než 50 molekulárních abnormalit u tumor supresorických genů a přes 100 v onkogenech, tedy ponejvíce molekul, které se podílejí na regulaci buněčného cyklu.

Cílem tohoto příspěvku je ukázat současná zadání pro genetický výzkum a klinickou genetickou praxi.

Genetická analýza na úrovni nádorové tkáně/buňky:

Tak jako i u jiných typů rakoviny vnitřních orgánů, i ve výzkumu rakoviny plic sílily v posledních letech požadavky poznat determinanty kancerogeneze na úrovni nádorové buňky - od jednoduchých rodinných cytogenetických (především strukturálních) variant, přes klasickou CGH až po současné metody molekulární genetiky na úrovni mikročipů.

V buňkách z rakoviny plic byly pozorovány nejrůznější genetické abnormality, jak na úrovni cytogenetické (chromosomální aberace), molekulárně genetické, tak i molekulárně cytogenetické (Obrázek 1). Nejběžnější genetickou alterací v primárním nádoru jsou mutace v genu p53 zjišťované jak sekvenční analýzou nádorové DNA, tak i na úrovni exprese proteinu v nádoru (imunohistochemie) - dle některých studií jsou tyto alterace negativním prognostickým faktorem přežití. Podobně jsou s horším přežíváním asociovány mutace a změněná exprese genu p21 či detekce bodových mutací v onkogenu K-ras nebo overexprese erbB-2.

Předmětem zájmu výzkumníků je kromě DNA izolované z periferní krve (příp. ze stěru bukání sliznice či fibroblastů), kde je pátráno po zárodečných mutacích nejrůznějších genů, též DNA izolovaná ze vzorků plicních nádorů získaných post mortem (nejčastěji parafinové řezy) či peroperačně (nativní nebo zamražená tkáň) nebo při instrumentálních diagnostických a bioptických výkonech (ponejvíce suspenze buněk při bronchoskopii, dále pak z bronchiální laváže či z biopsií při videothorakoskopii). Nověji je studována DNA původem ze sputa a dokonce v kondenzátech vydechovaného vzduchu. V několika posledních letech se, alespoň v zahraničí, zaměřuje pozornost na cirkulující nádorovou DNA izolovanou z plasmy, příp. séra.

Také my jsme nedávno tuto metodiku zavedli v DNA diagnostické laboratoři našeho ústavu s cílem kvantifikovat celkovou plasmatickou DNA u nádorových nemocných a pokusit se prokázat zastoupení DNA pocházející z nádorových buněk v celkové DNA izolované z plasmy a vyčíslit její podíl (Hirmerová et al., Poster č. 5 a tento sborník, JOD 2009).



Farmakogenetika terapie plicní rakoviny:

Zavedení celé řady polymorfismů (především enzymatických) a jejich testování u pacientů s nádory plic má za cíl individualizaci a tím i zkvalitnění protinádorové terapie. Typickým příkladem je stanovení genotypů µ (mí) a θ (théta) u glutathion s-transferasy (GSTM1 a GSTT1). Jde o enzym, který vykazuje antiapoptotickou aktivitu a účastní se též v resistenci buněk na protinádorovou chemoterapii (Carlsten et al., 2008).

Podobně významným je testování somatických mutací ve výše zmíněném EGFR pro terapii první generací inhibitorů EGFR (gefitinib a erlotinib) u pacientů s nemalobuněčnými formami plicní rakoviny (Lynch et al. 2004, Pugh et. al. 2007, Riely 2008).

Samostatnou kapitolu představuje výzkum genetických determinant v metastazování karcinomů plic, protože právě terapuetické blokování některých těchto molekul a mechanismů lze využít v prevenci metastáz (Yamashita et. al., 2007; Decock et al., 2008).

Predispoziční studie:

Hlavní směry aktuálního výzkumu na úrovni velkých populačních vzorků se zaměřují na asociační studie jednotlivých oblastí našeho genomu (GWAS) s predispozicí ke vzniku nádoru (ale i třeba s predispozicí ke kuřáckému habitu).

Plicní rakovina je onemocnění značně heterogenní (např. jednotlivé histotypy) a jen vzácně je součástí monogenních tzv. hereditárních nádorových syndromů. Považujeme ji za multifaktoriální onemocnění s účastí mnoha genů a výrazným vlivem prostředí (kouření aktivní i pasivní, průmyslové škodliviny atd.).

Vrozená predispozice k plicní rakovině je polygenně determinovaná. Přičemž jen zcela výjimečně lze u familiárních případů (početné případy ca plic opakující se ve více generacích) najít zárodečnou mutaci některého ze známých tumor supresorických genů (APC, RB1, NF2, MSH2 aj.).

Největší zastoupení v populaci však mají nádory sporadické (non-familiární, tj. bez opakování v rodině), kde předpokládáme predispozici způsobovanou dosud neznámými geny. Jednotlivé výsledky statistik si mnohdy protiřečily: některé popírají a jiné naznačují, že se zárodečné mutace ´velkých´ tumor supresorických genů p53, RB1 a p 16 (pravděpodobně) podílejí či nepodílejí na susceptibilitě ke karcinomu plic (Hwang et al. 2003, Dai et al. 2003). Další hypotetické lokusy (asi 20) byly vytipovány v experimentech na geneticky definovaném zvířecím modelu (rekombinantní kongenní myší kmeny, knock-out mutanty aj.) a jsou nyní studovány na základě syntenie mezi myšími a lidskými chromosomy (Démant 2003).

V posledních letech počet publikací, které se zabývají genetikou, molekulární genetikou a molekulární epidemiologií plicní rakoviny, nebývale narostl. Prvním takovým milníkem byl r. 2004, kdy bylo publikováno několik velkých multicentrických studií, které poukázaly na význam mutací v genu pro receptor epiteliálního růstového faktoru (EGFR) (Paetz et al. 2004, Pao et al. 2004, Lynch et al. 2004) a další velký lokus pro susceptibilitu k plicní rakovině byl mapován do 6q23-q25 (Bailey-Wilson et al., 2004). Jiné práce studují aberantní metylaci promotorů nejrůznějších genů jako biomarkerů pro diagnostiku plicní rakoviny (Hsu et al. 2005, Schmiemann et al. 2005).

Druhým ´zlomem´ byl nejspíše loňský rok, kdy tři nezávislé GWAS studie na různých kavkazských populacích (Amos, C.I. et al., 2008, Hung, R.J. et al., 2008, Thorgeirsson, T.E. et al., 2008) ukázaly na další lokusy susceptibility k rakovině plic (a zřejmě i závislosti na nikotinu), které mapují do oblasti genů pro podjednotky nikotinového acetylcholinového receptoru na chromosomu 15q25. Čtyři jednonukleotidové polymorfismy této oblasti jsme zavedli v naší laboratoři a na jiném místě (Hirmerová et al., Poster č. 5 a tento sborník, JOD 2009) přinášíme výsledky pilotní studie na české populaci.

Genetické poradenství:

Z pohledu praktické klinické genetiky jsou výstupy recentního výzkumu zatím omezeně použitelné a dostupné, nicméně klinické genetické poradenství v rodinách s výskytem plicních nádorů se postupně prosazuje ve světě a zavádíme je i na ambulanci našeho ústavu.

Při stanovování rizika opakování nádoru pro osoby dosud bezpříznakové se (podobně jako u jiných nádorů) zavádějí rizikové modely založené na dotaznících zaměřených na anamnestické údaje osobní a rodinné. Protože pro populaci ČR zatím takové nástroje nemáme, lze s určitými omezeními použít modely konstruované na kavkazských populacích jako jsou např. pravděpodobnostní tabulky Spitzové a kolektivu. (Spitz et al., 2007).

Ve klinické poradenské praxi jsme zachytili např. několik rodin na základě hospitalizace nemocného mladšího 55 let postiženého plicní rakovinou, kde se u blízkých příbuzných (též v mladších věkových kategoriích) nacházejí současně bronchogenní ca, ca tlustého střeva, ca žaludku, jakož i ca ovarií a dělohy, méně často pak ca ledvin (Obrázek 2). Nápadný je i výskyt nádorových duplicit v těchto rodinách. Koincidence rakoviny plic a tlustého střeva ve zmíněných rodinách implikuje otázku, zda alespoň u části nemocných bronchogenním karcinonem se na vzniku onemocnění nepodílejí mutace v genech (AFP, MUTYH, MMR aj.), které jsou v laboratoři ÚBLG 1. LF UK a VFN vyšetřovány již více než 10 let.

Spolupráce na výzkumu v ČR:

Specialistům v oboru pneumologie a onkologie nabízíme spolupráci při molekulárně genetickém výzkumu plicní rakoviny, především nemalobuněčných typů (NSCLC).

Předmětem našeho zájmu jsou vzorky plicních nádorů získaných post mortem (nejčastěji parafinové řezy) či peroperačně (nativní nebo zamražená tkáň) nebo při instrumentálních diagnostických a bioptických výkonech (ponejvíce suspenze buněk při bronchoskopii), dále pak vzorky periferní krve osob s nádorem i bez, zejména těch, které nikdy nekouřily. Ze vzorků nádorů a kontrolních budeme izolovat DNA a molekulárně genetické vyšetřování z nádorové a nenádorové (kontrolní, tj. periferní krev, vzdálená uzlina) tkáně se zaměří na stanovení mutátorového fenotypu nádorových buněk (detekce poruchy opravného systému MMS) a vybraných polymorfismů (cytochrom P, glutathion-S-transferáza, TP53 a další).

Další naši cílovou skupinu představují rodiny s opakovaným výskytem nádorových onemocnění plic ve více generacích, rodiny s více typy nádorů včetně rakoviny plic a konečně jedinci s nádorovými duplicitami či triplicitami (alespoň jeden primární nádor musí postihovat plíci) a jejich příbuzní.

Literatura:

1. Amos, C.I. et al.: Genome-wide association scan of tag SNPs identifies a susceptibility locus for lung cancer at 15q25.1. Nat. Genet., 40,616-622, 2008.
   
2. Bailey-Wilson, J. E.; Amos, C. I.; Pinney, S. M.; Petersen, G. M.; de Andrade, M.; Wiest, J. S.; Fain, P.; Schwartz, A. G.; You, M.; Franklin, W.; Klein, C.; Gazdar, A.; and 1 5 others : A major lung cancer susceptibility locus maps to chromosome 6q23-25. Am. J. Hum. Genet. 75: 460-474, 2004.
   
3. Carlsten C., Sagoo G.S., Frodsham A.J., Burke W., Higgins J.P.: Glutathione S-tranferarase M1 (GSTM1) polymorphism a nd lung cancer: a literature-based systematic HuGE review and meta-analysis. Am. J. Epidemiol. 167: 759 - 774, 2008.
   
4. Dai, Z.; Zhu, W.-G.; Morrison, C. D.; Brena, R. M.; Smiraglia, D. J.; Raval, A.; Wu, Y.-Z.; Rush, L. J.; Ross, P.; Molina, J. R.; Otterson, G. A.; Plass, C.: A comprehensive search for DNA amplification in lung cancer identifies inhibitors of apoptosis cIAP1 and cIAP2 as candidate oncogenes. Hum. Molec. Genet. 12: 791-801, 2003.
   
5. Decock J, Paridaens R, Ye S.: Genetic polymorphisms of matrix metalloproteinases in lung, breast and colorectal cancer. Clin Genet. 73(3):197-211, 2008.
   
6. Démant P.: Cancer susceptibility in the mouse: genetics, biology, and implications for human cancor. Nat. Rev. Genet. 4: 721-734,2003.
   
7. Hsu, H. S., Wen, C. K., Tang, Y. A., Lin, R. K., Li, W. Y., Hsu, W. H., Wang, Y. C.: Promoter hypermethylation is the predominant mechanism in hMLH1 and hMSH2 deregulation and is a poor prognostic factor in nonsmoking lung cancer. Clin. Cancer Res. 2005 Aug 1;11(15):5410-6.
   
8. Hung, R.J. et al.: A susceptibility locus for lung cancer maps to nicotinic acetylcholine receptor subunit genes on 1 5q25. Nature, 425, 633-637, 2008.
   
9. Hwang, S.-J.; Cheng, L. S.-C.; Lozano, G.; Amos, C. I.; Gu, X.; Strong, L. C. : Lung cancer risk in germline p53 mutation carriers: association between an inherited cancer predisposition, cigarette smoking, and cancer risk. Hum. Genet. 113: 238-243, 2003.
   
10. Lynch, T. J.; Bell, D. W.; Sordella, R.; Gurubhagavatula, S.; Okimoto, R. A.; Brannigan, B. W.; Harris, P. L.; Haserlat, S. M.; Supko, J. G.; Haluska, F. G.; Louis, D. N.; Christiani, D. C.; Settleman, J.; Haber, D. A.: Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib. New Eng. J. Med. 350: 2129-2139, 2004.
    
11. Paez, J. G.; Janne, P. A.; Lee, J. C.; Tracy, S.; Greulich, H.; Gabriel, S.; Herman, P.; Kaye, F. J.; Lindeman, N.; Boggon, T. J.; Naoki, K.; Sasaki, H.; Fujii, Y.; Eck, M. J.; Sellers, W. R.; Johnson, B. E.; Meyerson, M.: EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science 304: 1497-1500,2004.
    
12. Pao, W.; Miller, V.; Zakowski, M.; Doherty, J.; Politi, K.; Sarkaria, I.; Singh, B.; Heelan, R.; Rusch, V.; Fulton, L.;Mardis, E.; Kupfer, D.; Wilson, R.; Kris, M.; Varmus, H.: EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from ´never smokers´ and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc. Nat.Acad. Sci. 101: 13306-13311, 2004.
    
13. Riely GJ: The use of first-generation tyrosine kinase inhibitors in patients with NSCLC and somatic EGFR mutations. Lung Cancer 60, Suppl 2:S19-22, 2008.
    
14. Samara, K. et al.: Microsatellite DNA instability in benign lung diseases. Respir Med 100, 202-21, 2006.
    
15. Sequist, L. V., Josuu, V. A., Janne, P. A., Bell, D. W., Fidias, P., Lindeman, N. I., Louis, D. N., Lee, J. C., Mark, E. J., Longtine, J., Verlander, P., Kucherlapati, R., Meyerson, M., Haber, D. A., Johnson, B.E., Lunch, T. J.: Epidermal growth factor receptor mutation testing in the care of lung cancer patients. Clin. Cancer Res. 2006 Jul 15; 12(14 Pt 2): 4403s-4408s.
    
16. Schmiemann, V., Bocking, A., Kazimirem, M,. Onofre, A. S., Gabbert, H. E., Kappes, R., Gerharz, C. D., Grote, H. J.: Methylation assay for the diagnosis of lung cancer on bronchial aspirates: a cohort study. Clin. Cancer Res. 2005 Nov 1;11(21):7728-34.
    
17. Sozzi, G. et al.: Quantification of free circulating DNA as a diagnostic marker in lung cancer. J Clin Oncol 21,3902-3908, 2003
    
18. Spitz MR, Hong WK, Amos CI, Wu X, Schabath MB, Dong Q, Shete S, Etzel CJ: A risk model for prediction of lung cancer. J Natl Cancer Inst. 99(9):715-26, 2007.
    
19. Thorgeirsson, T.E. et al.: Avariant associated with nicotine dependence, lung cancer and peripheral arterial disease. Nature, 452, 638-642, 2008.
    
20. Xue, X., et al.: Circulating DNA and lung cancer. Ann NY Acad Sci 1075,154-164, 2006.
    
21. Yamashita S, Masuda Y, Matsumoto K, Okumura Y, Matsuzaki H, Kurizaki T, Haga Y, Katafuchi S, Murayama T, Ikei S, Kawahara K.: Down-regulation of the human PRL-3 gene is associated with the metastasis of primary non-small cell lung cancer. Ann Thorac Cardiovasc Surg. 13(4):236-9, 2007.