HISTONOVÉ DEACETYLÁZY A DNA METYLTRANSFERÁZY U PROSTATICKÝCH NÁDOROVÝCH BUNĚK

Východiska:

Metylace DNA katalyzovaná DNA metyltransferázami (DNMTs) je epigenetickou modifikací, která pokud je přítomna v promotorové ob­lasti příslušného genu, obvykle souvisí s potlačením transkripce. Naproti tomu acetylace histonů je spojována s aktivací transkripce. Hypoacetylace histonovými deacetylázami (HDACs) s metylací promotorových CpG ostrůvků nebo metylací histonových lyzinů může mít vliv na expresi tumor supresorových genů nebo inhibitorů cyklin-dependentních kináz.

Materiál a metody:

Použili jsme nádorové linie odvozené z nádorů prostaty lišící se citlivostí k andro­genům. Linie LNCaP je androgen senzitivní a exprimuje funkční AR. Prostatická nádorová linie DU145 reprezentuje buňky necitlivé k androgenům, které jsou bez exprese androgenového receptoru. Buňky obou linií jsme ovlivňovali butyrátem sodným (1 mM NaB a 5 mM NaB) a kombinacemi s 5-AzA-CdR (1 mM NaB + 5 uM 5-AzA-CdR a 5 mM NaB + 5 uM 5-AzA-CdR) po dobu 48 a 96 hod. Z ovlivněných a neovlivněných buněk byl pro imunoprecipitační analýzu použit proteinový lyzát obsahující formaldehydem fixovaný chromatin. DNA byla precipitována protilátkami proti acetylovanému histonu H3 a acetylovanému histonu H4. Změny v expresi DNMT1 a DNMT3 na histonech H3 a H4 byly detekovány amplifikací imunoprecipitované DNA. Exprese HDAC2 a HDAC3 byly sta­noveny na proteinové úrovni Western blotovou analýzou.

Výsledky:

Exprese proteinů HDAC2 a HDAC3 byla u obou linií snížena ve srovnání s neovlivně­nými buňkami po 48hodinovém působení 5 mM NaB. U linie LNCaP jsme po amplifikaci DNA imunoprecipitované s protilátkou proti H4 detekovali snížení exprese DNMT1 u všech ovlivnění po dobu 48 a 96 hod při srovnání s úrovní exprese DNMT1 detekované u neovlivněných buněk. Při současné aplikaci NaB a 5-AzA-CdR byl zaznamenán nižší inhibiční efekt na expresi DNMT1 než při použití samotného NaB. Tento efekt je nejvíce patrný po 96 hodinách půso­bení NaB na tuto linii. U linie DU145 jsme po amplifikaci DNA imunoprecipitované s protilátkou proti H3 ani H4 nepozorovali žádné změny v expresi DNMT1.

Závěr:

Ovlivnění prostatických nádorových buněk demetylačním činidlem (5-AzA-CdR), inhibitorem histonových deacetyláz (NaB) nebo jejich kombinací může vyvolat různé epigenetické modifikace. Na snížení exprese DNA metyltransferáz má větší vliv inhibitor histonových deacetyláz (NaB) než jeho kombi­nace s demetylačním agens. Komplexnost v působení epigenetických mechanizmů vyžaduje potřebu dalších podrobnějších analýz.

Práce byla financována interním grantem Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci LF_2012_019.