Hypoxií indukovaná chemorezistence buněk neuroblastomu a mozkových nádorů - studie in vitro.

Úvod

Mozkové nádory a neuroblastomy jsou nejčastější solidní nádory dětského věku. Tumory CNS tvoří 20% všech dětských nádorů a jsou nejčastějšími solidními nádory dětí. Neuroblastom se podílí na 8-10% nádorových onemocnění dětského věku a v průběhu prvního roku života je nejčastějším dětským nádorem. Přestože, úspěšnost léčby zhoubných nádorů dětského věku se výrazně zvýšila - pediatrická onkologie je v posledních dvaceti letech považována za obor, který dosáhl největších léčbných úspěchů - bylo u mozkových nádorů a neuroblastomu vysokého rizika zvýšení vyléčitelnosti jedno z nejmenších. Na častém vzniku recidiv u těchto nádorů se významně podílí vznik chemorezistence.

Na chemorezistenci a agresivnějším chování nádorů se podílí i jejich hypoxie. Prakticky ve všech solidních nádorech jsou v důsledku neadekvátní angiogeneze přítomny hypoxické oblasti. Změny exprese genů indukovaných hypoxií, které se podílejí na jejich vzniku a progresi byly prokázány u řady nádorů. Hypoxií indukovaný transkripční faktor (HIF) je hlavní transkripční faktor aktivovaný hypoxií. Je tvořen dvěmi podjednotkami ARNT/HIF-1α a hypoxií indukovanou HIF-1α s homology HIF-2α a HIF-3α. HIF-2α se podílí na dediferenciaci a agresivnějším fenotypu buněk neuroblastomu. Hypoxie je jednou z příčin snížení cytostatiky indukované apoptózy a zvýšení klonogenní rezistence a genetické nestability [1].

HIF-1α a HIF-2α jsou homologní proteiny, ale mají četné odlišnosti ve svých biologických účincích [2,3]. Z našich experimentů vyplývá, že hypoxie (1% kyslíku) u buněčných linií neuroblastomů a glioblastomu významně inhibuje apoptózu a přispívá tak k jejich rezistenci. Domníváme se, že antiapoptotické působení hypoxií indukovaných transkripčních faktorů je závislé přinejmenším na typu nádoru a použitém protinádorovém léčivu. Selektivní inhibicí těchto transkripčních faktorů pomocí specifických inhibitorů a siRNA můžeme lépe porozumět jejich úloze v indukci rezistence a inhibici programované buněčné smrti. Výsledky projektu přispějí k poznání biologie neuroektodermálních nádorů a podílu hypoxie na jejich biologických vlastnostech zvláště pak hypoxií navozené rezistence vůči cytostatikům. Průkaz některých proteinů nám může poskytnout významné prognostické či prediktivní znaky umožňující následnou individualizaci protinádorové léčby. Ovlivněním exprese konkrétních proteinů v podmínkách in vitro je možné navrhnout specifické terapeutické cíle.

Cíle

Stanovit citlivost buněčných liní neuroblastomu a od nich odvozených rezistentních linií k cisplatině, doxorubicinu a ellipticinu a buněčných linií mozkových nádorů (meduloblastom, glioblastom) v hypoxických a normoxických podmínkách in vitro a pokusit se zjistit mechanismy, které se podílí na vzniku hypoxií indukované rezistence.

Metody

Buněčné linie: neuroblastom N typu: IMR-32, UKF-NB-3; S typu: UKF-NB-4 a SK-NA-AS a od nich odvozené rezistentní linie; mozkových nádorů - meduloblastom: ATCC HTB 185 D 283, ATCC HTB 186 Daoy P 861, glioblastom: U87 a U373. Pro indukci hypoxického fenotypu buněk in vitro jsme použili hypoxickou komůrku (Billups-Rothenberg Inc.) naplněnou definovanou směsí plynů O₂ 1%, CO₂ 5%, N₂ 94%. Hypoxický fenotyp testovaných buněk jsme verifikovali stanovením exprese HIF proteinů a carbon anhydrasy IX, glut-1 a VEGF (Western blot, RT PCR). Citlivost k cytostatikům jsme stanovili MTT testem. Apoptozu jsme hodnotili morfologicky, aktivací kaspáz, obsahem buněčné DNA, vazbou Anexinu V a metodou TUNEL.

Výsledky a diskuze

U neuroblastomových linií byla největší hypoxií indukovaná rezistence k cisplatině, nižší byl ke karboplatině a doxorubicinu, nejnižší byla pro nově testované inhibitory histondeacetylázy valproát a trichostatin A, mezi jednotlivými buněčnými liniemi však byly značné rozdíly. Přehled IC₅₀ (inhibiční koncentrace 50 - udává při jaké koncentraci je počet buněk snížen o 1/2 oproti kontrole bez testované látky) v normoxii a v hypoxii (1% O₂) a faktor rezistence, který udává poměr IC₅₀ v hypoxii / IC₅₀ v normoxii uvádí TABULKA 1.

Inhibitor vazby HIF-1α na cílové geny - chetomin nesnižoval v neuroblastomových buňkách apoptozu indukovanou cisplatinou v hypoxii, ale zvyšoval jejich viabilitu. Dosud nedořešenou otázkou zůstává možnost potenciace účinku chemoterapie na hypoxické nádorové buňky inhibicí HIF v terapii. Dalším pravděpodobným mechanismem, který se podílí na hypoxií indukované chemorezistenci je snížení proliferační frakce. Všechny testované buněčné linie měly v hypoxii zvýšené zastoupení G0/G1 fáze, která je k působení většiny cytostatik méně citlivá než fáze S a G2/M. Proto je do terapie nádorů s rozsáhlými hypoxickými okrsky vhodné zařadit léky, které jsou účinné i na klidové buňky (busulfan, deriváty nitrosurey). Snížení protinádorového efektu elipticinu v hypoxii je podmíněno tvorbou menšího množství DNA adduktů v hypoxii než v normoxii [4]. Tato snížená tvorba adduktů je dalším mechanizmem, který způsobuje snížení účinku cytostatik vytvářejících addukty s DNA v hypoxii. Tvorba adduktů s DNA se uplatňuje na účinku nejen elipticinu, ale i antracyklinů, mitomycinu a derivátů platiny.



TABULKA 1.

Účinek různých cytostatik na nádorové buňky in vitro. IC₅₀ zjišťována MTT testem.
TSA - trichostatin A, VPA - kyselina valproová.

Závěry

Hypoxie významným způsobem snižuje citlivost neuroblastomových buněk a buněk mozkových nádorů k řadě cytostatik. Tuto rezistenci lze částečně zrušit inhibitorem funkce HIF-1α.

Práce byla finančně podporovaná Ligou proti rakovině Praha, MSMT (MSM0021620813) a GAUK 72208/2008.

Literatura:

1. Moeller BJ and Dewhirst MW. Br J Cancer. 2006;95(1):1-5.
2. Song X et al. Cancer Chemother Pharmacol. 2006;58(6):776-84.
3. Holmquist-Mengelbier L et al. Cancer Cell. 2006;10(5):413-23.
4. Poljakova J et al. Biochemical Pharmacology 2009;77(9) 14661479