Identifikácia pacienta s Lynchovým syndrómom bez zaznamenanej rodinnej anamnézy pomocou metódy MSI, MSP pre MLH1 a BRAF mutácie a NGS analýzy

Úvod: Lynchov syndróm je jedným z naj­častejších hereditárnych nádorových syndrómov spôsobený germinálnymi mutáciami v génoch systému MMR (mismatch repair) MLH1, MSH2, MSH6 a PMS2. Jedným z diagnostických kritérií je detekcia mikrosatelitnej instability (MSI) v ná­dorovom tkanive pacientov so zaznamenanou rodinnou anamnézou. Následne je indikovaná sekvenácia uvedených génov. MSI je definovaná ako rozdiel vo veľkosti špecifických STR (short tandem repeats) sekvencií v nádorovom tka­nive v porovnaní s ich veľkosťou v nenádorovom tkanive u tej istej osoby. Okrem germinálnych mutácií môže byť príčinou MSI aj somatická hypermetylácia CpG ostrovčekov v oblasti promótoru MLH1 a iných génov a vyskytuje sa v spo­radických kolorektálnych karcinómoch (KRK). V sporadických KRK s MSI je pozorovaný aj častý výskyt mutácie V600E génu BRAF. Stanovenie MSI v tkanivách pacientov s KRK spolu s identifikáciou proteínovej expresie pomocou imunohistochémie (IHC), hypermetylácie MLH1 a mutácie V600E BRAF predstavujú nový nástroj na stratifikáciu pacientov so sporadickým a dedičným KRK.

Materiál a metodika: Zatiaľ sme analyzo­vali vzorky DNA od 100 pacientov operovaných v UNM s KRK diagnostikovaným na základe pred­chádzajúcich histopatologických vyšetrení. DNA sme izolovali z parafínových rezov a MSI analýza bola uskutočnená pomocou MSI Analysis System, Version 1 (Promega USA) s piatimi monunukleotidovými STR markermi v automatickom gene­tickom analyzátore AB3500 podľa protokolu vý­robcu. Ako MSI-H boli vyhodnotené vzorky s viac ako jedným nestabilným markerom, MSI-L pred­stavujú vzorky s jedným nestabilným markerom a MSS sú vzorky bez nestabilného markera. BRAF mutácie V600E sme analyzovali pomocou alelovo-špecifickej PCR a verifikovali sekvenáciou podľa Sangera pomocou BDT v1.1 (Thermo Fisher, USA). Na detekciu metylácie MLH1 sme využili nested metylačne-špecifickú PCR v pro­mótorovej oblasti génu. Na NGS analýzu sme využili TrueSight Cancer Panel (Illumina, USA), knižnicu sme pripravili podľa návodu výrobcu a NGS analýzu sme previedli na zariadení MiSeq. Bioninformatické vyhodnotenie bolo spracované pomocou Variant Studio software za spolupráce so spoločnosťou Genetica.

Výsledky: Zo 100 vzoriek KRK sme zistili 17 s MSI-H, z ktorých 10 bez V600E mutácie v géne BRAF. Jeden pacient bol na základe týchto vý­sledkov (vrátane IHC) odporučený na genetickú konzultáciu. Z DNA izolovanej z krvi tohto pa­cienta bola v pomocou NGS analýzy zistená mu­tácia posunová mutácie, delécia 4 nukleotidov, ktorá dosiaľ nebola opísaná c. 1627_1630del AAAG, p. (Glu544Lysfs*) v exóne 4 génu MSH6. Keďže pacient podstúpil aj molekulovú diagnos­tiku cez zazmluvneného poskytovateľa, bola táto mutácia potvrdená aj Sangerovou sekvenáciou a bola vylúčená aj delécia pomocou metódy MLPA.

Záver: Stanovenie MSI, analýza prítomnosti BRAF mutácie a MLH1 metylácie spolu s imunohistochemickým vyšetrením MMR proteínov a v tkanivách pacientov s KRK nám dávajú nové možnosti skríningu pacientov s dedičným a spo­radickým KRK.

Táto štúdia bola podporená grantovým proje­ktom MZSR 2012/24-UKMA-1 „Detekcia prediktívne relevantných parametrov v diagnostickom algo­ritme bioptického vyšetrenia karcinómu hrubého čreva a pľúc" a projektom financovaným zo štruk­turálnych fondov EÚ„Martinské centrum pre biomedicínu (BioMed Martin)", ITMS kód 262202201787.