Měďnaté komplexy naftochinonů jako nové cytotoxické látky.

Úvod

Naftochinony představují v přírodě méně rozšířené sekundární metabolity, vznikající v několika různých biosyntetických cestách v závislosti na konkrétním naftochinonu. Nejčastěji se jedná o jednoduché deriváty 1,4-naftochinonu (juglon, lawson, plumbagin), jsou známy také formy dimerní a trimerní, stejně jako složitě substituované naftochinony. Naftochinony byly nalezeny u zástupců řady rostlinných čeledí, stejně jako u mikroorganismů a hub (Babula et al.; Babula et al.). V buňkách jsou deponovány ve vakuolách, kde jsou rozpuštěny (ve formě glykosidů) (Duroux et al.). Naftochinony představují látky s velmi zajímavým, a také širokým spektrem účinků. Mezi nejvýznamnější patří vlastnosti cytotoxické, antimikrobiální, antivirální, antifun-gální, antiparazitální a insekticidní. Některé naftochinony plní nezastupitelnou úlohu fyziologickou a biochemickou - jedná se o vitamíny skupiny K, strukturální analoga 1,4-naftochinonu substituované izoprenovým řetězcem různé délky (Damon et al.).

Významnou vlastností naftochinonů je jejich cytotoxicita. Ta je založena na několika paralelně probíhajících mechanizmech, mezi které patří generování reaktivních forem kyslíku poškozujících veškeré biomolekuly, aktivace proapoptických a down-regu-lace antiapoptických genů vedoucích v případě živočišných buněk k apoptóze, stejně jako interakce s biosyntézou nukleových kyselin, inhibice topoizomeráz i interakce s vlastní DNA, zejména interkalace (Babula et al.; Kiran Aithal et al.). Zajímavou možnost modifikace biologických účinků naftochinonů představuje příprava jejich derivátů a komplexů, jak již bylo prokázáno v případě dalších sekundárních metabolitů, ale také vlastních naftochinonů (Hashem et al.; Hernandez-Molina et al.; Chang et al.; Kelkar et al.; Kumbhar et al.). Zajímavou možnost obměny a vystupňování biologických účinků představuje příprava komplexů sekundárních metabolitů s ionty těžkých kovů. Jako zajímavé se jeví komplexy kvercetinu s mědnatými ionty, které vykazují schopnost přímé interakce s DNA a potažmo tedy výrazné cytotoxické vlastnosti (Tan et al.). Z tohoto důvodu byly tedy zcela nově připraveny různé komplexy naftochinonu lawsonu (2-hydroxy-1,4-naftochinon) s mědí, které byly dále charakterizovány z pohledu jejich biologických aktivit. Pro prescreeningové studie, stejně jako studie fytotoxicity, je velmi vhodná buněčná suspenzní kultura tabáku BY-2, přirovnávaná k HeLa buňkám (Nagata et al.). Výsledky získané pomocí této buněčné kultury vykazují v řadě ohledů korelaci s výsledky získanými na buňkách živočišných, nenádorových i nádorových (Babula et al.; Babula et al.; Smejkal et al.). Cílem předložené práce je tedy studium cytotoxicity jednoho z komplexů lawsonu a mědi (jako Cu2+) na modelové buněčné suspenzní kultuře BY-2.

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Materiál a metody

Chemikálie

Pro syntézu komplexů byl použit lawson (Law, 2-hydroxy-1,4-naftochinon), octan měďnatý, resp. jeho monohydrát ((CH₃COO)₂Cu.H₂O), a další chemikálie p. a. čistoty (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Pro vlastní experiment - testovaní cytotoxicity - byl vybrán nejjednodušší komplex složení Cu(Law)₂(H₂O)₂.1/2H₂O (sumárně C₂₀H₁₅CuO₈₅, Mr = 454,89, rozpustnost H₂O, ethanol, dimethysulfoxid - DMSO), který byl připraven na ÚCHL FaF VFU Brno. Jeho složení a stabilita byla ověřena elementární analýzou a metodami spektrálními. Příprava tohoto komplexu, stejně jako komplexů dalších, bude popsána v jiné publikaci.

Rostlinný materiál

Pro testování cytotoxicity byl použit rostlinný buněčný model - buněčná suspenzní kultura Nicotiana tabacum cv. Bright Yellow-2 (BY-2), kultivovaná v tekutém MS kultivačním médiu (Murashige and Skoog) modifikovaném dle Nagaty (Nagata et al.). Buněčná suspenzní kultura byla kultivována při 27 °C ve tmě na třepačce (Kuhner Shaker LT-W, Adolf Kuhner AG, Švýcarsko) při 130 rpm. Testovaný komplex lawsonu ve formě zásobního roztoku (DMSO, 1 mg.ml^-1), stejně jako měďnaté ionty (jako octan -(CH₃COO)₂Cu.H₂O; H₂0, 1 mg.ml^-1) a lawson (DMSO, 1 mg.ml^-1), byl aplikován k buněčné kultuře v exponenciální fázi růstu, a to ve finálních koncentracích 0, 50, 100, 250, 500, 750 a 1000 μM a triplikátech. Jako další kontrola byl použit DMSO v koncentraci 0.5 % (v/v). Vzorky byly odebírány v časových intervalech 12, 24, 48 a 72 hodin.

Stanovení viability a další cytologická vyhodnocení

Životnost - viabilita - byla stanovena mikroskopicky za použití dvojitého fluorescenčního barvení pomocí fluorescein diacetátu (FDA) a propidium jodidu (PI), oba Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA). Princip stanovení viability je založen na rozkladu FDA na vlastní fluorigenní substrát esterázami živých buněk a penetraci PI buněčnou stěnou a porušenou plazmatickou membánou buněk mrtvých s následnou DNA interkalací. Sterilně odebraný vzorek (25 µl) byl doplněn kultivačním médiem na objem 50 µl a kultivován po dobu 5 min s FDA (2.4 µmol.l-1) a PI (30 µmol.l-1). Počet živých a mrtvých buněk byl vyhodnocen pomocí fluorescenčního mikroskopu (Olympus AX 70) se širokopásmovou UV excitací, vlastní viabilita byla stanovena jako podíl buněk živých ke všem buňkám. Od každé experimentální varianty bylo vyhodnoceno 10 náhodných polí, a to v triplikátu. Jaderná architektura, stejně jako mitotický index, byla hodnocena pomocí fluorescenčního barviva Hoechst 33258. Ve stručnosti: vzorek (500 µl) byl smíchán s PEM pufrem obsahujícím formaldehyd (4 %, w/w) (500 µl). Od každé experimentální varianty bylo vyhodnoceno tisíc jader, a to pomocí fluorescenční mikroskopie (Olympus AX70, širokopásmová UV excitace). Jaderné změny, stejně jako mitotický index, byly vyjádřeny procentuálně.

VÝSLEDKY A DISKUSE

Morfologické změny a viabilita

Aplikace všech tří látek, tj. komplexu Cu(Law)₂(H₂O)₂.1/2H₂O, měďnatých iontů i lawsonu, vedla ke změnám v morfologii buněk buněčné suspenzní kultury BY-2. Pro sledování viability, stejně jako buněčné struktury, byly použity FDA a PI. Kontrolní buňky se vyznačovaly přítomností několika vakuol, dobře patrných jader a ohraničených provazců cytoplazmy oddělujících jednotlivé vakuoly. V případě komplexu, spolu s klesající viabilitou byly patrné výrazné změny v buněčné struktuře, zejména nejasné ohraničení vakuol, jader a provazců cytoplazmy, stejně jako difúzní probarvení celé buňky degradačním produktem FDA -fluoresceinem, což naznačuje pravděpodobnou schopnost komplexu ovlivňovat permeabilitu biomembrán, a tím vyvolávat zánik buněk (obr. 1). Tyto změny korelovaly s koncentrací komplexu, ale nebyly patrné v případě měďnatých iontů a lawsonu. Nejvíce cytotoxický byl komplex, nejméně naopak měďnaté ionty (obr. 2). Pokles viability o více jak 80 % v případě nejvyšších koncentrací, tj. 500 a 1000 µM, a to již po 12 hodinách kultivace, svědčí o schopnosti komplexu vyvolávat rychlý zánik buněk, tedy interagovat a porušovat permeabilitu biomembrán, případně interferovat s buněčným energetickým metabolizmem, jak bylo zjištěno v případě některých naftochinonů.

Mitotický index

Všechny testované látky byly k buněčné suspenzní kultuře BY-2 aplikovány v exponenciální fázi růstu, kdy mitotický index, tj. procento dělících se buněk, dosahoval 6 %. Aplikace všech látek vedla ke snížení mitotického indexu, v případě nejvyšších aplikovaných koncentrací pod 1 %. Pokles mitotické aktivity byl nejvýraznější v případě komplexu, kdy byla zjištěna rovněž kumulace buněk v anafázi, nejméně výrazný naopak v případě mědnatých iontů.

Obr. 1. Morfologické změny buněk BY-2 po 24 hodinách kultivace.

A - kontrola (šipka označuje jádro mrtvé buňky), B - komplex aplikovaný v koncentraci 100 µM a C - 500 µM.





Obr. 2. Cytotoxické vlastnosti komplexu, lawsonu a mědi jako Cu(II).

A - cytotoxicita komplexu v koncentracích 0 až 1000 µM.

B - porovnání cytotoxicity mědi jako Cu(II), lawsonu (Law) a komplexu po 24 hodinách kultivace.

Jaderné změny a programovaná buněčná smrt

Aplikace komplexu v dané koncentrační řadě, stejně jako mědnatých iontů ve formě octanu a naftochinonu lawsonu vedla ke zřetelným změnám v jaderné struktuře. Mezi nejčastější změny patřila kondenzace chromatinu (na periferii jádra i kolem jadérka), změny typického tvaru jader a přítomnost tzv. „apoptic-like bodies", tedy fragmentovaných jader; právě jejich přítomnost, která navíc byla doprovázena typickým smrštěním cytoplazmy, svědčí o schopnosti testovaných látek vyvolávat programovanou buněčnou smrt (obr. 3). V nejnižších koncentracích, tj. 50 a 100 μM, dominovala přítomnost ´apoptic-like bodies´ v případě komplexu, ve vyšších koncentracích, tj. 500 a 750 μ M, pak v případě mědnatých iontů - Cu(II).

Závěr

Testovaný komplex naftochinonu lawsonu a měďnatých iontů - Cu(Law)₂(H₂O)₂.1/2H₂O - projevil výraznou cytotoxicitu, výraznější ve srovnání se samotným lawsonem nebo ionty měďi. V případě nižších koncentrací komplexu byly patrné jaderné změny související s programovanou buněčnou smrtí a vyšší viabilita, což by nasvědčovalo schopnosti komplexu vyvolávat buněčné změny vedoucí k programované buněčné smrti, ale nevedoucí k velmi rychlému zániku buněk, např. v důsledku porušení energetického metabolizmu buněk, nebo změnám permeability biomembrán.




Obr. 3. Jaderná morfologie a apoptické změny po 24 hodinách po aplikaci komplexu; A - kontrola, B - 100 μM a C - 250 μM.

Graf vyjadřuje porovnání procenta apoptických změn jako „apoptic-like bodies" (vyznačeno na fotografiích šipkami) v různých koncentracích mědi jako Cu(II), lawsonu a komplexu po 24 hodinách kultivace.

Naopak vyšší koncentrace komplexu vedly k velmi rychlému zániku buněk, beze změn ve směru programované buněčné smrti, což svědčí o pravděpodobné interferenci komplexu jak s biomembránami, tak i metabolizmem buněk. Otázkou zůstává mechanizmus účinku komplexu. Vzhledem k tomu, že cytotoxicita komplexu je vyšší v porovnání s lawsonem a ionty mědi, je možné, že komplex je v buňkách štěpen na lawson a Cu(II), které působí synergicky. Komplex se nerozkládá ve vodném prostředí, jak prokázal test stability, tudíž je předpoklad, že je buňkami přijímán a pravděpodobně dále metabolizován za vzniku Cu(II)a law-sonu; ty působí synergickým účinkem, který je komplexní, a vede k zániku buněk. Komplex tedy vykazuje zajímavé biologické vlastnosti, což jej činí zajímavým pro další testování biologických aktivit, stejně jako interakcí s biomolekulami, např. DNA.



Poděkování

Práce byla podporována grantovým výzkumnými projekty: GAČR P301/10/0356, INCHEMBIOL MSM0021622412.

Literatura

1. Babula, P., et al., (2007): Naftochinony a jejich farmakologické vlastnosti. Česká a Slovenská farmacie, 56: 114-120.
2. Babula, P., et al., (2009): Noteworthy Secondary Metabolites Naphthoquinones - their Occurrence, Pharmacological Proper-ties and Analysis. Current Pharmaceutical Analysis, 5: 47-68
3. Babula, P., et al., An influence of cisplatin on tobacco cell culture Nicotiana tabacum BY-2. In: P. Ryant, et al., Eds.), Men-delNet05 Agro, Mendel University of Agriculture and Forestry in Brno, Brno, Czech Republic, 2005, pp. 97-97
4. Babula, P., et al., (2006): Naftochinony - biosyntéza, výskyt a metabolismus v rostlinách. Česká a Slovenská Farmacie, 60: 151-159
5. Babula, P., et al., (2007): An influence of cisplatin on the cell culture of Nicotiana tabacum BY-2. Plant Soil and Environment, 53: 350-354
6. Damon, M., et al., (2005): Phylloquinone (vitamin K1) content of vegetables. Journal of Food Composition and Analysis, 18: 751-758
7. Duroux, L., et al., (1998): Insight into naphthoquinone metabolism: beta-glucosidase-catalysed hydrolysis of hydrojuglone beta-D-glucopyranoside. Biochemical Journal, 333: 275-283.
8. Hashem, E. Y., et al., (2000): Spectrophotometric study of the complexation equilibria of zinc(II) with lawsone, juglone and naphthazarin. Indian J. Chem. Sect. A., 39: 889-895
9. Hernandez-Molina, R., et al., (2007): Complexes of Co(II), Ni(II) and Cu(II) with lapachol. Polyhedron, 26: 4860-4864.
10. Chang, H. X., et al., (1999): Design of antineoplastic agents based on the "2-phenylnaphthalene-type" structural pattern. 4. Synthesis and biological activity of 2-chloro-3-(substituted phenoxy)-1,4-naphthoquinones and related 5,8-dihydroxy-l,4-naphthoquinones. Jornal of Medicinal Chemistry, 42: 405-408.
11. Kelkar, V. D., et al., (1998): Synthesis and characterisation of Ho(III) a chelates of some juglones. Indian J. Chem. Sect. A.,37: 915-917
12. Kiran Aithal, B., et al., (2009): Juglone, a naphthoquinone from walnut, exerts cytotoxic and genotoxic effects against cultu-red melanoma tumor cells. Cell Biology International, 33: 1039-1049
13. umbhar, A., et al., (1996): Cytotoxic properties of iron-hydroxynaphthoquinone complexes in rat hepatocytes. Biometals, : 235-240
14. Murashige, T., Skoog, F., (1962): Arevised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 15: 473-497.
15. Nagata, T., et al., (1992): Tobacco BY-2 cell-line as the HeLa-cell in the cell biology of higher plants. A Surv. of Cell Biol., 132: 1-30.
16. Smejkal, K., et al., (2008): Cytotoxic Activity of C-Geranyl Compounds from Paulownia tomentosa Fruits. Planta Medica, 74: 1488-1491.
17. Tan, J., et al., (2009): DNA binding and oxidative DNA damage induced by a quercetin copper(II) complex: potential mecha-nism of its antitumor properties. J Biol Inorg Chem, 14: 727-739.