Možnosti detekce mutací v onkogenu k-ras.

Onkogen k-ras patří mezi důležité nádorové markery. K-ras kóduje protein s GTPázovou aktivitou o velikosti 21 kDa. Jeho fyziologickou funkcí, jako důležité součásti signálních buněčných kaskád, je zprostředkovat přenos podnětů z aktivovaných membránových receptorů do buněčného jádra a stimulovat tak buněčnou proliferaci a diferenciaci. V procesu karcenogeneze velmi často dochází k poškození k-ras genu bodovými mutacemi, které vedou ke konstitutivní aktivaci K-ras proteinu. Ve většině případů jsou přítomny tyto mutace v prvním exonu genu (převážně v kodónu 12 a 13) a vedou k záměně glycinu za aminokyselinu s jinými vlastnostmi, nejčastěji za kyselinu asparagovou s kyselým charakterem.
Mutace v onkogenu k-ras jsou běžné v nádorech slinivky břišní, tlustého střeva, v adenokarcinomu plic a dalších. Výskyt mutace indikuje horší prognózu onemocnění často spojenou s chemorezistencí nádorových buněk. Rovněž přítomnost mutace v k-ras genu je negativním prediktivním znakem pro použití cílené terapie pomocí inhibitorů EGFR1. Naší snahou je optimalizovat co nejsenzitivnější metodu detekce mutace genu k-ras, kterou bude moci využít pro běžné testování velkých souborů pacientů. Pro zatím jsme se zaměřili na specifické vyšetření kodónu 12, ve kterém zaznamenáváme téměř 90% všech mutací. Naše analýzy byly provedeny na souboru 63 vzorků DNA karcinomu plic. Zavedli jsme 3 různé metody detekce, které jsme porovnávali jak z hlediska detekčního limitu tak finanční a časové náročnosti. První metoda - alelicko specifické PCR využívá specifické vazby primeru na jednotlivé typy sekvence. Její optimalizace je velmi obtížná a objevuje se u ní vyšší pravděpodobnost falešně pozitivních výsledků. Další analýza pomocí High Resolution Melting Curve (HRM) je založena na křivkách tání jednotlivých PCR produktů. Tato metoda je finančně a časově nenáročná. Její nevýhodou je nižší citlivost detekce oproti druhým sledovaným metodám. Posledním námi zaváděným vyšetřením je selektivní PCR (REMS-restriction endonuclease-mediated selective PCR). Při použití REMS PCR dochází ke štěpení zdravého typu sekvence, což umožňuje vyšší amplifikaci sekvencí obsahujících mutaci, které jsou následně detekovány. U této metody jsme dosáhli nejvyšší citlivosti. V celém souboru jsme provedli konfirmační vyšetření pomocí přímé sekvenace nebo pyrosekvenování. S rozvojem biologické terapie narůstá požadavek stanovení mutačního statutu genu k-ras jako prognostického a prediktivního markeru u řady nádorových onemocnění. Tento trend vyžaduje prescreening velkých souborů vzorků některou z robustních metod, na kterou bude navazovat následné přímé ověření mutace standardní metodou.