Princip multiplexové analýzy a její využití v onkologické praxi

Multiplexová analýza je moderní a rychle se rozvíjející metodou stanovení biomarkerů v různých klinických materiálech. Jedná se o kombinaci průtokové cytometrie a imunoanalytického stanovení. Základem stanovení jsou molekulární reakce probíhající na barevně kódovaných mikrokuličkách. Až 100 různě kódovaných sad mikrokuliček, nesoucích různé biologické „sondy“ (tj. reagencie specifické pro jednotlivé analýzy – antigeny, protilátky, oligonukleotidy, enzymové substráty nebo receptory) pro navázání analytu ze vzorku, umožňuje 100 různých reakcí v jediném alikvotu vzorku, objem vzorku pro analýzu je navíc zapotřebí jen 10–50 mikrolitrů. Testy probíhají na povrchu mikrokuliček a množství reakcí, představující množství stanovovaného analytu, je určeno pomocí fluorescenčně značených referenčních molekul, jež se naváží na molekuly analytu zachycené na mikrokuličkách. Poté jsou mikrokuličky s použitím tzv. nosné kapaliny v řadě za sebou vnášeny do dráhy paprsků dvou laserů o rozdílné vlnové délce. Jeden z laserů excituje směs barviv zabudovanou v mikrokuličkách a určuje druh analytu, druhý laser excituje fluorescenčně značené referenční molekuly na povrchu mikrokuliček a stanovuje množství analytu. Tento systém multiplexové analýzy má tedy dvě hlavní výhody:

1. možnost stanovení až 100 analytů v jediném alikvotu vzorku
2. malý objem vzorku potřebný pro analýzu – 10– 50 µL.

Tyto výhody předurčují metodu pro výzkum, kde je k dispozici jen omezený objem vzorku (práce s laboratorními zvířaty, zpracovávání materiálu z tkáňových kultur a pod). V rutinní praxi se nepochybně metodika uplatní pro vyšetřování biologicky aktivních látek u novorozenců a v pediatrii obecně. Nové možnosti se objeví při vyšetření bioptického materiálu. Současné vyšetření rozsáhlého panelu látek umožní daleko podrobněji studovat nejen etiopathogenezi, ale i dynamiku chorobného procesu.

V současné době jsou již v rutinní diagnostice používány panely pro stanovení autoprotilátek, což nejen zlepšuje diagnostiku, ale umožní i objektivní kontrolu léčby autoimunních chorob. Nové možnosti nabízí multiplexová analýza v onkologii Existující panely na stanovení cytokinů, adhesivních molekul, metaloproteináz a apoptotických markerů, kromě toho že přispějí k lepšímu pochopení invazivity nádoru a procesu metastázování, umožní i daleko spolehlivě určovat prognózu nádorového onemocnění. Nezastupitelné místo bude mít nepochybně multiplexová analýza při volbě, optimalizaci a individualizaci léčby v onkologii. Nepochybně své využití najde i při dynamických dlouhodobých studiích při zkoušení a klinickém ověřování nových léků. Umožní zvolit kombinaci parametrů podle potřeby s ohledem na charakter prováděné terapie a studovat i vzájemné interakce parametrů. V současné době se jedná o metodu především výzkumnou, ale velice rychle je možno očekávat její použití v rutinní každodenní klinické praxi. Je nutno se zmínit i o některých nevýhodách této metody pro klinickou praxi, což jsou především dlouhé časy inkubace (14–18 h), a tedy nelze analýzy provádět statimově, a též se metoda nevyplatí pro malý počet vzorků (<10). V naší laboratoři se již několik měsíců zabýváme stanovením cytokinů, interleukinů a adhezivních molekul v lidském séru a plazmě. Výsledky těchto studií budou uvedeny v rámci prezentace.