Sledování kovalentně vázaného doxorubicinu do DNA izolované z nádorových buněk neuroblastomu.

Chemoterapie je velmi významnou součástí léčby zhoubných nádorů. Jednou z velkých nevýhod chemoterapie jsou její často poměrně rozsáhlé vedlejší účinky (Brigger et al.; Dhalla et al.; Fink et al.; Lasic; Szakacs et al.; Weiss). Cílem je vyvinout chemoterapeutická léčiva s nízkou toxicitou, což není snadným úkolem. Nověji je pozornost také věnována individuálnímu přístupu v chemoterapii. Individualizace terapie pak vyžaduje navržení a aplikaci technologií snadné, rychlé a levné detekce koncentrace léčiva. Největšího pokroku v individualizaci dávkování léčiv bylo dosaženo v oblasti aplikace inzulinu a monitorování hladiny glykémie. Chemoterapeutika mají různá místa svého biologického účinku jedním z míst jsou interkalace do struktury DNA. Protinádorovýúčinek je založen na vazbě interkalačních činidel do jejich struktury. Vazbou do molekuly DNA není umožněno polymeráze zabezpečit replikaci nebo transkripci. Oba tyto děje jsou pro buňku velmi významné. Interkalační činidla jsou většinou planární molekuly, které s dusíkatými bazemi DNA vytváří vodíkové můstky, případně iontové interakce či koordinační vazby. Pro léčbu nádorových onemocnění je v léčebných protokolech vyžíván doxorubicin. Doxorubicin byl izolován jako protinádorové antibiotikum. Jeho nevýhodou je však horší rozpustnost ve vodném prostředí, proto se v současnosti hledají postupy jak doxorubicin lépe aplikovat (lipidové kapsle). Pro sledování interakcí a vztahu proteinů, nukleových kyselin a nízkomolekulárních látek je využívána celá baterie analytických technik a postupů. Současné technologie se zaměřují především na aplikace hmotnostní spektrometrie MALDI a SELDI či tandemové detekce MS/MS. Nevýhody těchto postupů jsou především v nezbytné úpravě vzorku před jeho vlastní analýzou. Další velmi intenzivně rozvíjenou oblastí jsou techniky array technologií zaměřené na sledování expresní profilů, kde finanční náklady na provoz jsou vysoké a reprodukovatelnost analýz je stále intenzivně zkoumána. V rámci těchto technik nachází uplatnění elektrochemická detekce (Huska et al.; Huska et al.; Masarik et al.; Prusa et al.).

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Materiál a metody

Elektrochemická analýza: Elektrochemické měření bylo prováděno na přístroji Autolab (EcoChemie, Nizozemí) ve spojení s VA-Stand 663 (Metrohm, Švýcarsko) v ťříelektrodovém zapojení. Jako pracovní elektroda byla použita visící rtuťová kapková elektroda - HMDE (plocha Hg kapky = 0,4 mm²), referenční elektroda (Ag/AgCl, 3M KCl) a uhlíková tyčinka jako pomocná elektroda. Všechna elektrochemická měření byla provedena v acetátovém pufru pH = 4 který, byl připravován ze zásobních roztoků 0,2 M kyseliny octové a 0,1 M octanu sodného, technikou SWV voltametrie při frekvenci 120 Hz.

Neuroblastomové buněčné linie: UKF-NB-3 neuroblastomové linie byly odvozeny z metastáz neuroblastomu do kostní dřeně a byly získány od J. Cinatl (J. W. Goethe University, Frankfurt, Germany). K doxorubicinu resistentní linie byla získána inkubací buněk s postupně rostoucími koncentracemi doxorubicinu. Byly následně označeny jako UKF-NB-3 (DOXO). Buňky byly kultivovány v DMEM médiu s přídavkem 5% fetálního séra a pasážovány v intervalu po čtyřech dnech. Kultivace probíhala v inkubátoru při 37 °C a 5% CO₂. DNA byla izolována obvyklým postupem (fenol/chloroformovou extrakcí) z buněčných linií běžným postupem.

Výsledky a diskuse

Naše hlavní pozornost se zaměřila na sledování interakce protinádorového léčiva doxorubicinu s nukleovými kyselinami. Velmi dobré redoxní vlastnosti doxorubicinu umožnují jeho snadné stanovení pomocí DPV (y = 596x + 14, R2 = 0.9921, s limitem detekce v subnanomolárních koncentracích). V našich experimentach bylo zjištěno, že interkalovaný doxorubicin snižuje pozorovaný redoxní signál CA (cytosin/adenin) dsDNA, ale také poskytuje redoxní signál DOXO při potenciálu kolem -0.35 V. Předpokládá se, že interkalační činidla jsou transportována mezi řetězce nukleové kyseliny kde dochází ke vzniku vodíkových případně koordinačních vazeb. Změny, které takto interkalované činidlo na molekule DNA způsobí mohou vést k zastavení replikace případně transkripce. O kovaletntních vazbách s bazemi takových činidel je známo velmi málo, ale jak naznačují některé experimentální práce lze očekávat jejich vznik především na molekule guaninu. V našem experimentu jsme se pokusili sledovat interkalace doxorubicinu do molekuly DNA. Molekula dsDNA na povrchu elektrody vytvoří uspořádanou vrstvu, která může reagovat s interkalačním činidlem (doxorubicinem). DNA modifikovaná elektroda je zbavena nenavázaných molekul DNA a pře nesena do roztoku obsahujícího doxorubicin. Po proběhlé interakci je nespecificky vázaný doxorubicin z povrchu elektrody odmyt. DNA s interkalovaným doxorubicinem je přenesena do základního elektrolytu kde probíhá vlastní elektrochemické měření. Z výsledků je zřejmá vyšší variabilita (kolem 15 %) způsobená především velmi obtížně definovanými podmínkami na povrchu pracovní elektrody při tvorbě různých nepříliš dobře definovaných povrchových vrstev. I přes tyto nepříznivé faktory bylo možné pozorovat pokles signálu CA v molekule dsDNA (směrnice -2.4x) a nárůst redoxního signálu DOXO (směrnice 14.3x) v průběhu interkalačního experimentu. Z výsledku je jasně patrné, že interkalace doxorubicinu do molekuly dsDNA na elektrodě je rychlá, avšak výraznější změna je pozorována až po 4 minutách interakce.

Obr. 1

Elektrochemický (CV) záznam doxorubicinu při různých rychlostech polarizace.

Signál dsDNA bez kovalentně vázaného doxorubicinu (tenká čára) a s kovalentně vázaným doxorubicinem (tlustá čára).

Sledování interkalovaných molekul do struktury nukleové kyseliny není přiliš mnoho a v řadě případů naráží na velmi složité technické a materiální vybavení. V našem experimentu jsme se pokusili navrhnout jednoduchý postup jak rozpoznat změny v DNA s interkalovaným a neinterkalovaným doxorubicinem. Pro tento experimentální účel bylo využito savčích buněčných kultur, které byly vystaveny působení doxorubicinu. Před vlastní elektrochemickou analýzou byla z buněk izolována DNA. Izolační postup zajišťuje, že pro analýzu byla použita pouze DNA, která obsahuje interkalovaný doxorubicin. DNA neuroblastomových buněk kultivovaných v přítomnosti doxorubicinu byla izolována stejným způsobem jako u kontrolní skupiny. Získané závislosti jsou rozdílné především při sledování změny signálu u nízké koncentrace dsDNA. Interkalovaný doxorubicin snižuje redoxní signály CA dsDNA a pravděpodobně také dochází k dalším strukturním změnám, které se projevují v různé tvorbě vrstev na povrchu pracovní elektrody. Na SW voltamogramech byl pozorován kromě signálu CA dsDNA také signál odpovídající doxorubicinu. Signál doxorubicinu s narůstající aplikovanou koncentrací vzrůstal.

Závěr

Jak bylo demonstrováno elektrochemické metody je možné použít pro sledování interkalačních změn doxorubicinu do molekuly DNA.

Poděkování

Práce byla podporována grantovým výzkumnými projekty: GAČR NANIMEL 102/08/1546, GAČR P301/10/0356, Výzkumným centrem BIO-ANAL-MED LC06035 a GA AVIAA401990701.

Literatura

1. Brigger, I., et al., (2002): Nanoparticles in cancer therapy and diagnosis. Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 631-651.
2. Dhalla, N. S., et al., (2000): Role of oxidative stress in cardiovascular diseases. Journal of Hypertension, 18: 655-673.
3. Fink, D., et al., (1998): The role of DNAmismatch repair in drug resistance. Clinical Cancer Research, 4: 1-6.
4. Huska, D., et al., (2009): Square-Wave Voltammetry as a Tool for Investigation of Doxorubicin Interactions with DNA Isolated from Neuroblastoma Cells. Electroanalysis, 21: 487-494.
5. Huska, D., et al., (2009): Electrochemical and computational study of doxorubicin interactions with DNA. Febs Journal, 276: 109-109.
6. Lasic, D. D., (1998): Novel applications of liposomes. Trends in Biotechnology, 16: 307-321.
7. Masarik, M., et al., (2009): Doxorubicin and genomic DNA, new insights in drug-nucleic acids interactions. International Journal of Molecular Medicine, 24: 277.
8. Prusa, R., et al., (2009): In vivo and in vitro electrochemical investigation of doxorubicin/ellipticine interaction with DNA. Clinical Chemistry, 55: A217-A217.
9. Szakacs, G., et al., (2006): Targeting multidrug resistance in cancer. Nature Reviews Drug Discovery, 5: 219-234.
10. Weiss, R. B., (1992): THE ANTHRACYCLINES - WILL WE EVER FIND A BETTER DOXORUBICIN. Seminars in Onco-logy, 19: 670-686