Konference: 2005 XXIX. Brněnské onkologické dny a XIX. Konference pro sestry a laboranty
Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie
Téma: Pokroky v molekulární biologii nádorů
Číslo abstraktu: 054
Autoři: Mgr. Jitka Petrlová, Ph.D.; O. Blaštík; doc.RNDr. Vojtěch Adam, Ph.D.; R. Mikelová; MUDr. Lucia Trnková; Prof. MUDr. Richard Průša, CSc.; F. Jelen; doc.Ing. René Kizek, Ph.D.
Klíčová slova
Metalothionein; kovy vázající proteiny; interakce; EDTA; těžké kovy; visící kapková rtuťová elektroda; diferenční pulzní voltametrie; krevní sérum; lidská moč
Úvod
V posledních deseti letech je věnována pozornost zvýšené expresi metalothioneinu v lidských tkáních v souvislosti s rakovinovým onemocněním. Jedná se zejména o nádory epiteliálních buněk tzv. karcinomy, vycházející jak z povrchového epitelu tak i epitelu žláz jednotlivých orgánů. Množství metalothioneinu je v nádorech studováno jako nový prognostický faktor: i) v progresi onemocnění ii) přežití pacientů iii) korelací s histologickým typem iv) stupněm onemocnění v) nádorovým gradingem a vi) výskytem metastáz. K analýze obsahu MT byla vypracována řada technik. Významné postavení mají imunologické techniky. V laboratorní diagnostice jsou využívány monoklonální protilátky označené jako E9. Značnou nevýhodou imunologických technik je příprava protilátek. Z tohoto důvodu jsou hledány metody, které budou vysoce specifické, senzitivní a přitom nebudou instrumentálně náročné. Takovou možnost nabízejí metody elektrochemické. Cílem této práce bylo studium interakce metalothioneinu se silným chelatačním činidlem ethylendiamin– N, N, N`, N`-tetraoctovou kyselinou (EDTA).
Materiál a Metody
Chemikálie
MT z králičích jater (MW 7143), obsahující 5,9 % Cd a 0,5 % Zn, byl zakoupen u firmy Sigma Aldrich (St. Louis, USA). Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) byl vyroben Molecular Probes (Evgen, Oregon, USA). Chlorid sodný, EDTA a ostatní použité chemikálie byly získány v čistotě ACS od společnosti Sigma Aldrich. Zásobní roztok standardu MT 10 µg.ml-1 byl připraven za využití ACS vody (Sigma-Aldrich, USA) a uložen ve tmě při –20 °C. Pracovní standardní roztoky byly vždy připravovány denně a to naředěním ze zásobního roztoku.
Elektrochemické stanovení
Elektrochemické stanovení bylo provedeno pomocí přístroje AUTOLAB analyzátor (EcoChemie, Netherlands), který byl napojený na VA-Stand 663 (Metrohm, Switzerland), používala se pracovní cela s tříelektrodovým systémem. Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm2. Referentní elektroda byla Ag/AgCl/3M KCl a pomocná elektroda byla uhlíková tyčinka. Základní elektrolyt byl 0,5 M NaCl, pH 6,4 kyslík byl odstraněn bubláním argonem pro dobu 120 s. DPV parametry: poč áteč ní potenciál -1,2 V, koneč ný potenciál -0,3 V, modulač ní č as 0,057 s, step potenciál 1,05 mV/s a modulační amplituda 25 mV.
Výsledky a diskuse
Elektrochemické chování metalothioneinu
Nejdříve jsme přistoupili k základní elektrochemické mcharakterizaci metalothioneinu (1µM) (králičí játra, Mr 7065, MTCd5Zn2) pomocí diferenční pulzní voltametrie v základním elektrolytu 0,5 M chloridu sodného. Získali jsme voltametrické křivky na kterých byly velmi dobře pozorovatelné signály při potenciálu kolem -0,95 V, -0,65 V a -0,40 V. Pozorované signály odpovídají navázaným těžkým kovům (kadmium, zinek) do klasterů metalothioneinu (Obr. 1).
Interakce EDTA s metallothioneinem
Je známo, že ethylenediamin-N, N, N`, N`-tetraoctová kyselina (EDTA) je schopna intenzivně vyvazovat těžké kovy i z biologických struktur. Na základě spektrofotometrických měření se předpokládá, že interakce mezi EDTA a MT probíhá podle následujících kroků i) MTCd5Zn2 + EDTA = zhroucení klasterů a vzniká M-S-protein (M – těžký kov; T – thionein) ii) M-S-protein = M+ S– protein = M+ + S– protein a iii) M+ + EDTA– = MEDTA m[Yue, 1996 #122]. V našich experimentech bylo k 1µM MTCd5Zn2 postupně přidáváno rozdílné množství EDTA, až do konečné mkoncentrace 500 µM. Po každém přidání EDTA, byl roztok intenzivně míchán (1400 rpm) a probubláván argonem do dobu 240 s. Po ukončení reakce byla měřena voltametrická křivka. Zjistili jsme, že se vzrůstající koncentrací EDTA dochází k poklesu signálů při potenciálech -0,95 V (zinek vázaný do MT) a -0,40 V (kadmium vázané do MT). Signál při potenciálu -0,6 V se vzrůstající koncentrací EDTA postupně vzrůstal (Obr. 2).
S postupně zvyšující se koncentrací EDTA signály MT(Zn) a MT(Cd) postupně vymizí. MT ze kterého byly pomocí EDTA
odstraněny všechny kovy poskytl pouze jeden signál při potenciálu -0,60 V.
Závěr
V našich experimentech se podařilo pomocí elektrochemických technik prokázat, že EDTA intenzivně vyvazuje těžké kovy z metalothioneinu. Pomocí námi navrženého postupu je možné připravit a velmi snadno detekovat protein neobsahující ve své molekule ionty těžkých kovů. Takto připravený protein je možné využít pro podrobnější studium interakcí MT s těžkými kovy, a především s protinádorovými léčivy.
Literatura
Metalothionein; kovy vázající proteiny; interakce; EDTA; těžké kovy; visící kapková rtuťová elektroda; diferenční pulzní voltametrie; krevní sérum; lidská moč
Úvod
V posledních deseti letech je věnována pozornost zvýšené expresi metalothioneinu v lidských tkáních v souvislosti s rakovinovým onemocněním. Jedná se zejména o nádory epiteliálních buněk tzv. karcinomy, vycházející jak z povrchového epitelu tak i epitelu žláz jednotlivých orgánů. Množství metalothioneinu je v nádorech studováno jako nový prognostický faktor: i) v progresi onemocnění ii) přežití pacientů iii) korelací s histologickým typem iv) stupněm onemocnění v) nádorovým gradingem a vi) výskytem metastáz. K analýze obsahu MT byla vypracována řada technik. Významné postavení mají imunologické techniky. V laboratorní diagnostice jsou využívány monoklonální protilátky označené jako E9. Značnou nevýhodou imunologických technik je příprava protilátek. Z tohoto důvodu jsou hledány metody, které budou vysoce specifické, senzitivní a přitom nebudou instrumentálně náročné. Takovou možnost nabízejí metody elektrochemické. Cílem této práce bylo studium interakce metalothioneinu se silným chelatačním činidlem ethylendiamin– N, N, N`, N`-tetraoctovou kyselinou (EDTA).
Materiál a Metody
Chemikálie
MT z králičích jater (MW 7143), obsahující 5,9 % Cd a 0,5 % Zn, byl zakoupen u firmy Sigma Aldrich (St. Louis, USA). Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) byl vyroben Molecular Probes (Evgen, Oregon, USA). Chlorid sodný, EDTA a ostatní použité chemikálie byly získány v čistotě ACS od společnosti Sigma Aldrich. Zásobní roztok standardu MT 10 µg.ml-1 byl připraven za využití ACS vody (Sigma-Aldrich, USA) a uložen ve tmě při –20 °C. Pracovní standardní roztoky byly vždy připravovány denně a to naředěním ze zásobního roztoku.
Elektrochemické stanovení
Elektrochemické stanovení bylo provedeno pomocí přístroje AUTOLAB analyzátor (EcoChemie, Netherlands), který byl napojený na VA-Stand 663 (Metrohm, Switzerland), používala se pracovní cela s tříelektrodovým systémem. Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm2. Referentní elektroda byla Ag/AgCl/3M KCl a pomocná elektroda byla uhlíková tyčinka. Základní elektrolyt byl 0,5 M NaCl, pH 6,4 kyslík byl odstraněn bubláním argonem pro dobu 120 s. DPV parametry: poč áteč ní potenciál -1,2 V, koneč ný potenciál -0,3 V, modulač ní č as 0,057 s, step potenciál 1,05 mV/s a modulační amplituda 25 mV.
Výsledky a diskuse
Elektrochemické chování metalothioneinu
Nejdříve jsme přistoupili k základní elektrochemické mcharakterizaci metalothioneinu (1µM) (králičí játra, Mr 7065, MTCd5Zn2) pomocí diferenční pulzní voltametrie v základním elektrolytu 0,5 M chloridu sodného. Získali jsme voltametrické křivky na kterých byly velmi dobře pozorovatelné signály při potenciálu kolem -0,95 V, -0,65 V a -0,40 V. Pozorované signály odpovídají navázaným těžkým kovům (kadmium, zinek) do klasterů metalothioneinu (Obr. 1).
Interakce EDTA s metallothioneinem
Je známo, že ethylenediamin-N, N, N`, N`-tetraoctová kyselina (EDTA) je schopna intenzivně vyvazovat těžké kovy i z biologických struktur. Na základě spektrofotometrických měření se předpokládá, že interakce mezi EDTA a MT probíhá podle následujících kroků i) MTCd5Zn2 + EDTA = zhroucení klasterů a vzniká M-S-protein (M – těžký kov; T – thionein) ii) M-S-protein = M+ S– protein = M+ + S– protein a iii) M+ + EDTA– = MEDTA m[Yue, 1996 #122]. V našich experimentech bylo k 1µM MTCd5Zn2 postupně přidáváno rozdílné množství EDTA, až do konečné mkoncentrace 500 µM. Po každém přidání EDTA, byl roztok intenzivně míchán (1400 rpm) a probubláván argonem do dobu 240 s. Po ukončení reakce byla měřena voltametrická křivka. Zjistili jsme, že se vzrůstající koncentrací EDTA dochází k poklesu signálů při potenciálech -0,95 V (zinek vázaný do MT) a -0,40 V (kadmium vázané do MT). Signál při potenciálu -0,6 V se vzrůstající koncentrací EDTA postupně vzrůstal (Obr. 2).
S postupně zvyšující se koncentrací EDTA signály MT(Zn) a MT(Cd) postupně vymizí. MT ze kterého byly pomocí EDTA
odstraněny všechny kovy poskytl pouze jeden signál při potenciálu -0,60 V.
Závěr
V našich experimentech se podařilo pomocí elektrochemických technik prokázat, že EDTA intenzivně vyvazuje těžké kovy z metalothioneinu. Pomocí námi navrženého postupu je možné připravit a velmi snadno detekovat protein neobsahující ve své molekule ionty těžkých kovů. Takto připravený protein je možné využít pro podrobnější studium interakcí MT s těžkými kovy, a především s protinádorovými léčivy.
Literatura
- S.E. Theocharis, A.P. Margeli, A. Koutselinis, Int. J. Biol.
Markers 18 (2003) 162.
- J. Zelená, J. Vacek, J. Petrlová, J. Hradecký, R. Kizek, in R.
Vyzula, J. Žaloudík (Editors), XXVIII. Brněnské onkologické dny,
Masarykův onkologický ústav, Brno, 2004, p. 91.
- J. Zelená, D. Potešil, J. Vacek, V. Adam, J. Hradecký, R.
Prusa, R. Kizek, B. Vojtěšek, Klinická onkologie 17 (2004)
190.
- V. Adam, J. Zehnalek, J. Petrlova, D. Potesil, B. Sures, L.
Trnkova, F. Jelen, J. Vitecek, R. Kizek, Sensors 5 (2005)
70.
- V. Adam, J. Petrlova, D. Potesil, J. Zehnalek, B. Sures, L.
Trnkova, F. Jelen, R. Kizek, Electroanalysis in press
(2005).
- M. Dabrio, A.R. Rodriguez, Analusis 28 (2000) 370.
- M. Dabrio, A.R. Rodríguez, Anal. Chim. Acta. 406 (2000)
171–181.
- M. Dabrio, A.R. Rodríguez, Anal. Chim. Acta. 424 (2000)
77–90.
- M. Dabrio, A.R. Rodríguez, G. Bordin, M.J. Bebianno, M. De Ley,
I. Šestáková, M. Vašák, M. Nordberg, J. Inorg. Biochem.
88 (2002) 123–134. - M.S. Díaz-Cruz, J. Mendieta, R. Tauler, M. Esteban, J. Inorg.
Biochem. 66 (1997) 29–36.
- M.S. Díaz-Cruz, J. Mendieta, A. Monjonell, R. Tauler, M.
Esteban, J. Inorg. Biochem. 70 (1998) 91–98.
- M.S. Díaz-Cruz, J. Mendieta, R. Tauler, M. Esteban, Anal. Chem.
71 (1999) 4629–4636.
- M.S. Díaz-Cruz, J.M. Díaz-Cruz, J. Mendieta, R. Tauler, M.
Esteban, Anal. Biochem. 279 (2000) 189–201.
- M.S. Díaz-Cruz, M. Esteban, A.R. Rodríguez, Anal. Chim. Acta.
428 (2001) 285–299.
- M.S. Díaz-Cruz, J. Mendieta, M. Esteban, Electroanalysis 14
(2002) 50–56.
- O. Blaštik, J. Petrlová, V. Adam, D. Potěšil, V. Beňová, R.
Průša, M. Stiborová, B. Vojtěšek, L. Trnková, F. Jelen, R. Kizek,
XXIX. Brněnské onkologické dny (2005).
Příspěvek vznikl za podpory grantů RASO 2005, FRVŠ 2348/F4a a GAČR 525/04/P132
Datum přednesení příspěvku: 26. 5. 2005
