Studium mechanismu působení ellipticinu na neuroblastomové buněčné linie

Úvod

Neuroblastom, maligní embryonální nádor dětského věku, je odvozený z nezralých a nediferencovaných buněk neurální lišty osídlujících paravertebrální sympatická ganglia, dřeň nadledviny a paraganglií. Tyto nádory jsou značně biologicky variabilní. Nádory nízkého rizika často samovolně regredují, případně spontánně či při léčbě diferencují v ganglioneuroblastom i v benigní ganglioneurom (Brodeur, 2003). Prognóza úspěšné léčby neuroblastomů vysokého rizika (HR NBL) je velmi nízká. U většiny pacientů vzniká rezistence na podávaná cytostatika, přestože z počátku na léčbu odpovídali. A to i přes intenzivní léčbu včetně megaterapie s následnou transplantací kostní dřeně, bioterapie a imunoterapie (Brodeur, 2003). Oblastí zájmu je tedy snaha o nové možnosti léčby tohoto onemocnění.

Ellipticin (5,11-dimethyl-6H-pyrido[4,3-b]karbazol) a některé jeho deriváty jsou alkaloidy rostlin čeledi Apocynaceae s významnou protinádorovou aktivitou (Mathé et al., 1998). Důvodem zájmu o ellipticin je jeho vysoká účinnost proti nádorovým buňkám (již v koncentracích řádově rovných 0,1 – 1 µM) a jeho relativně nízké vedlejší toxické účinky. Limitující toxicitou je xerostomie (asialie), která může vyvolávat další nežádoucí účinky jako monilázy nebo anorexie. S výjimkou nefrotoxicity, která je svým mechanismem vzniku podobná nefrotoxicitě cis-platiny, jsou další vedlejší nežádoucí účinky ellipticinu minimální. Hematologická toxicita je dokonce prakticky nulová (Klener, 1996, Diop et al., 1984). Nicméně ellipticin a jeho 9-hydroxyderivát jsou silnými mutageny vykazujícími mutagenní aktivitu vůči kmenům Salmonella typhimurium, Neurospora crassa, Escherichia coli a jsou mutagenní i vůči buňkám savčím (De Marini et al., 1992).

Ellipticin zastavuje buněčný cyklus regulací exprese cyklinu B1 a Cdc2, stejně tak fosforylací Cdc2 a indukuje apoptózu tvorbou cytotoxických volných radikálů, aktivací Fas/Fas ligandového systému, regulací proteinů rodiny Bcl-2 a zvyšováním hladiny p53 tím způsobem, že je schopen obnovit aktivitu mutantního p53 a iniciovat tak apoptózu mitochondriální cestou (Kuo et al.,2005). Ellipticin také odpřahuje mitochondriální oxidativní fosforylaci (Schwaller et al., 1995), čímž narušuje buněčnou energetickou rovnováhu. Je známo, že zastavení buněčného cyklu v důsledku chemoterapie je většinou způsobeno poškozením DNA, vyvolaným řadou chemoterapeutik. U ellipticinu se předpokládá, že jeho protinádorová, mutagenní a cytotoxická aktivita, která je determinována poškozením DNA, je dána především interkalací jeho planární molekuly do dvoušroubovice DNA a inhibicí topoisomerasy II (Auclair et al., 1987).

V naší laboratoři bylo prokázáno, že ellipticin, po enzymové aktivaci cytochromy P450 (především CYP3A4, 1A a 1B1) a peroxidasami (laktoperoxidasou, myeloperoxidasou nebo cyklooxygenasami 1 a 2) in vitro a in vivo, je také kovalentně vázán na DNA (Stiborová et al., 2004, Stiborová el al., 2007, Stiborová el al., 2008). Na základě těchto poznatků lze ellipticin považovat za látku, jejíž farmakologická účinnost a/nebo vedlejší genotoxické účinky závisí na jeho enzymové aktivaci v buňkách cílových tkání.

V této práci bylo sledováno, zda je ellipticin účinný vůči lidským neuroblastomovým buněčným liniím IMR-32, UKF-NB-3, UKF-NB-4 a linii resistentní k ellipticinu UKF-NB-4^(Elli). Cílem práce bylo poznání cytotoxicity této sloučeniny a objasnění molekulárního mechanismu jeho působení na studované neuroblastomové buněčné linie.


Obr. 1. Autoradiografie aduktů ellipticinu s DNA neuroblastomových linií IMR-32 (A), UKF-NB-3 (B) a UKF-NB-4 (C) vystavených působení 10 µM ellipticinu 48 h, jaterní DNA potkanů exponovaných 40 mg ellipticinu/kg (D), v DNA inkubované s 13-hydroxyellipticinem (E) a 12-hydroxyelipticinem (F). Analýzy byly prováděny metodou 32P-postlabeling, její versí využívající nukleasu P1 pro intensifikaci detekce aduktů (Stiborová et al., 2004, 2007, 2008).

Materiál a metody

Neuroblastomové linie UKF-NB-3 a UKF-NB-4, odvozené z metastasí kostní dřeně HR NBL, byly poskytnuty Prof. J. Cinatlem, Jr. (J. W. Goethe University, Frankfurt, Germany). Linie IMR-32 pochází z komerčního zdroje (LGC Promochem, Wesel, Germany). Cytotoxicita ellipticinu (Sigma, St. Louis, MO, USA) byla sledována MTT testem, který spočívá v redukci žlutého rozpustného 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromidu na nerozpustné modré krystaly formazanu, jak je popsáno v naší předchozí práci (Poljaková et al., 2007). Analýzy vlivu ellipticinu na buněčný cyklus neuroblastomů, indukce apoptózy a exprese mRNA a proteinů metabolizujících ellipticin byly prováděny postupy popsanými v naší práci (Poljaková et al., 2009). Tvorba kovalentních aduktů aktivovaného ellipticinu s DNA byla sledována metodou 32P-postlabeling jak je popsáno dříve (Stiborová et al., 2004, 2007, 2008).

Výsledky a diskuse

Expozice neuroblastomových buněčných linií ellipticinu (1 a 10 µM, 48 hodin) indukuje „arrest“ buněčného cyklu linií IMR-32 a UKF-NB-4 v S fázi, zatímco buněčný cyklus linie UKF-NB-3 je zastaven v G0/G1 a G2/M fázi. Zjistili jsme, že tyto efekty jsou asociovány s tvorbou dvou kovalentních aduktů ellipticinu s DNA, identickými s adukty tvořenými metabolity této sloučeniny, 13-hydroxya 12-hydroxyellipticinem, tvořenými cytochromy P450 and peroxidasami (Obr. 1), s deoxugunaosinem v DNA. Kromě těchto dvou hlavních aduktů byly v buněčné linii UKF-NB-4 vystavené 48 hodin ellipticinu o koncentraci 10 µM nalezeny ještě dva minoritní adukty – adukt 6 a 7. Z dřívějších studií v naší laboratoři vyplývá, že tyto minoritní adukty jsou tvořeny in vitro po oxidaci ellipticinu především peroxidasami.

V jednotlivých buněčných liniích byla analyzována exprese enzymů metabolizujících ellipticin, a to jak na úrovni mRNA, tak i na úrovni proteinů. Ve všech studovaných buněčných liniích byla detekovaná mRNA enzymů CYP1A1, 1B1, 3A4, COX-1 a 2, avšak hladiny mRNA COX-2, CYP3A4 a 1A1 byly v parentálních liniích extrémně nízké. Ve všech studovaných buněčných liniích byla rovněž detegována exprese proteinů některých enzymů aktivujících ellipticin, a to CYP1A1, 1B1 a 3A4, na rozdíl od COX-1 a 2, jejichž expresi jsme za našich experimentálních podmínek v neuroblastomových buňkách nedetekovali.

Množství aduktů tvořených ellipticinem v DNA buněk neuroblastomových linií IMR-32 a UKF-NB-4 korelovalo s toxicitou ellipticinu vůči těmto liniím. Navíc, kultivace těchto neuroblastomových linií za hypoxických podmínek vedla k poklesu toxicity ellipticinu, který koreloval se snížením množství aduktů s DNA.

Závěr

Výsledky získané v této studii jasně prokazují, že ellipticin je účinným agens snižujícím růst neuroblastomových buněčných linií a signalizují, že tvorba kovalentních aduktů DNA s ellipticinem po jeho enzymové aktivaci v neuroblastomových liniích IMR-32 a UKF-NB-4, je rozhodujícím mechanismem vedoucím k cytotoxicitě tohoto léčiva vůči uvedeným nádorovým liniím.

Literatura

1. Auclair C. Arch Biochem Biophys 1987;259:1.
2. Broduer GM. Nat. Rev. Cancer 2003;3:203.
3. De Marini DM, Abu-Shakra A, Gupta R, Hender LJ, Levine JE. Environ. Mol. Mutagen 1992;20:12.
4. Diop B, Toure P, Sow MT, Toure M, Halliez ML, Castaigner JP, Mondestr JM, DeJaeger R. Med. Afr. Noire 1984;31:107.
5. Klener P: Protinádorová chemoterapie. Praha: Galén 1996
6. Kuo PL, Hsu YL, Kuo YC, Chang CH, Lin CC. Anti-Cancer Drugs 2005;16:789.
7. Mathé G, Triana K, Pontiggia P, Blanquet D, Hallard M, Morette C. Biomed. Pharmacother. 1998;52:391.
8. Poljaková J, Eckschlager T, Hraběta J, Hřebačková J, Smutný S, Frei E, Martínek V, Kizek R, Stiborová M. Biochem. Pharmacol. 2009, v tisku.
9. Poljaková J, Frei E, Gomez JE, Aimová D, Eckschlager T, Hraběta J, Stiborová M. Cancer Lett. 2007;252:270.
10. Schwaller MA, Allard B, Lescot E, Moreau F. J Biol Chem 1995;270:22709.
11. Stiborová M, Arlt VM, Henderson CJ., Wolf CR, Kotrbová V, Moserová M, Hudeček J, Phillips DH, Frei E. Toxicol. Appl.Pharmacol. 2008;226:318.
12. Stiborová M, Sejbal J, Bořek-Dohalská L, Aimová D, Poljaková J, Forsterová K, et al. Cancer Res 2004;64:8374.
13. Stiborová M, Poljaková J, Ryšlavá H, Dračínský M, Eckschlager T, Frei E. Int J Cancer 2007;120:243.

Poděkování

Práce vznikla za finanční podpory MŠMT (MSM0021620813 a 1M0505)