Systém pro in vitro analýzu sekvenčních variací v genu brca1 u pacientek s dědičným karcinomem prsu

Mutace v genu BRCA1 (Breast Cancer 1; OMIM 113705) jsou zodpovědné za vznik více než 50% dědičných karcinomů prsu a/nebo ovaria. Většina patogenních alterací v genu BRCA1 má charakter posunových mutací s předčasnou terminací translace, avšak do současnosti bylo nalezeno několik tisíc alterací genu s nejasným funkčním významem, který komplikuje klinickou interpretaci těchto variant. Nejasný je i vliv většiny alternativních sestřihových variant BRCA1 mRNA na funkci proteinu v buňce. Pro charakterizaci biologického významu missense mutací a alternativních sestřihů genu BRCA1 doposud chybí spolehlivý test, který umožnil charakterizaci těchto genetických změn in vitro.
Na základě výsledků mutační analýzy populace žen s hereditární formou karcinomu prsu a/nebo ovaria jsme vybrali populačně specifické alterace v genu BRCA1 [c.181T > G, c.1747A > T, c.3700_3704del5, c.5266dupC, D(3), D(5), D(9), D(9,10), D(14,15), D(14-18), D(16–23), D(21)]. Analyzované alternativní sestřihové varianty byly vytvořeny v plasmidu pcDNA3.1 a vybrané mutace byly zkonstruovány v systému bakteriálního arteficiálního chromozomu (BAC), nesoucího genomový insert obsahující celou sekvenci genu BRCA1 (~100 kb) včetně regulačních sekvencí. Konstrukce mutací v BAC byla zprostředkována rekombinačním systémem bakteriofága λ, kdy s využitím tzv. „hit & fix“ metody je možné zkonstruovat i subtilní genové změny jako jsou jednonukleotidové záměny.
Pro simulaci výpadku funkční wt alely genu BRCA1 v nádorových buňkách byla použita metoda RNAi. Vybrané linie karcinomu prsu (MCF-7, MB-MDA-231) byly infikovány dvěma typy retrovirů (MLP, pSUPER) exprimujícími small-hairpin RNA(shRNA) zaručující dlouhotrvající RNAi efekt. ShRNA byly navrženy specificky na 3’-UTR oblast genu BRCA1 a na sekvence chybějící v alternativně sestřižených variantách genu BRCA1. Buněčné klony s trvale sníženou expresí genu BRCA1 byly selektovány puromycinem. Míra snížení exprese BRCA1 byla charakterizována pomocí kvantitativní real-time PCR a western blottingu.
Kvantitativní real-time PCR prokázala snížení exprese BRCA1 mRNA o ~ 50% pomocí shRNA proti 3’UTR sekvenci v pozici 6 009, 6 285 a 6 806 (ostatní testované shRNA v 3’ – UTR a ORF nebyly funkční). Efekt shRNA byl specifický pro buněčné linie (downregulační efekt v HeLa buňkách v.s. minimální efekt v MB-231 buňkách) a nebyl závislý na použitém expresním systému (pSUPER v.s. MLP retrovirové plasmidy). Efekt shRNA na expresi BRCA1 proteinu bude analyzován pomocí western blotingu.
Konstrukce mutací genu BRCA1 v systému BAC zaručuje jeho expresi ve fyziologických podmínkách se zachovalou intracelulární regulací. Společně s metodou RNA interference (RNAi) tvoří versatilní systém, který umožňující funkční analýzu sekvenčních variant genu BRCA1 s doposud nejasným významem.

Projekt výzkumu byl podporován grantem IGA č. NR/8345-4.