Účinek reoviru na nádorové buňky

Možnosti liečebných modalít u nádorov sú obmedzené a zlyhávajú práve u najčastejšie sa vyskytujúcich nádorov, preto sa stále hl‘adajú nové liečebné postupy. Jednou z foriem génovej terapie sú i onkolytické vírusy, ktoré sa replikujú v nádorových bunkách a ničia ich, avšak v zdravých tkanivách sa nemnožia. Delia sa do 3 skupín: 1.) prirodzene sa vyskytujúce (napr. vírus Newcastelskej choroby, reovírus); 2.) s inaktiváciou génov nevyhnutných k replikácii v normálnych bunkách, ale množiace sa v nádorových (napr. adenovírus ONYX 015 replikujúci sa jedine v bunkách s defektom p53 alebo herpes vírus G207 vyžadujúci ribonukleotid reduktázu); 3.) s vloženým špecifickým promotorom (napr. adenovírusy CV706 PSA restrigovaný a adMycTk viažuci sa na protein myc). Vo svete už prebiehajú klinické štúdie s onkolytickými vírusmi, v ČR doposial‘ neprebiehajú.
Cie l‘om našej práce bolo získať prvé informácie o správaní sa a pôsobení prirodzeného onkolytického reovírusu na nádorové bunky in vitro a o možnosti jeho kombinácie s cytostatikami. Reovírus serotypu 3, Dearing, je prirodzene sa vyskytujúci nepatogénny nemodifikovaný vírus, ktorý využíva aktivovanú Ras signálnu dráhu (alebo jej časť) nádorových buniek, čím spôsobuje ich lýzu. Aktivácia Ras onkogénu vedie k inaktivácii bunkových antivírusových mechanizmov tak, že špecificky odstraňuje translačný blok pre vznik reovírusových transkriptov. Nenádorové bunky však neovplyvňuje, a preto nevyvoláva manifestné ochorenie. V týchto dňoch prebiehajú klinické štúdie fázy I a II s Reolysinom (Reovírus serotypu 3 kmeň Dearing). Metódy: na všetky experimenty sme použili Reovírus serotypu 3 kmeň Dearing nami použitý vírus je identický s Reolysinom, ale nebol schválený pre použitie v klinickém štúdii. Použité linie MK-16, TC-1 myšacie onkogénne bunkové línie pripravené transfekciou gény E6/E7 l‘udského papiloma vírusu typu 16 (HPV 16) a s aktivovaným H-ras onkogénom. Od mozgových nádorov odvodené línie jedna v našom laboratóriu pripravená línia odvodená od glioblastoma multiforme a tri línie odvodené od meduloblastómu ATCC HTB 185 (D 283), ATCC HTB 186 (Daoy), ATCC HTB 187 (D 341). Ako kontrolu sme použili normálne l‘udské fibroblasty.

Účinok reovírusu na bunky sme hodnotili MTT testom. Táto metóda je založená na redukcii žltého solubilného MTT na modrý nerozpustný formazán na mitochondriálnej membráne živých buniek. Zafarbenie sa vyhodnocuje spektrofotometricky při vlnovej dæžke 570 nm a hodnota absorbancie roztoku odpovedá množstvu živých buniek. Porovnávali sme účinok samotného reovírusu a v tkanivovej kultúre, ku ktorej bola pridaná cisplatina, vinkristín alebo vepezid v množstve menšom než IC50.
Výsledky: Reovírus serotypu 3, kmeň Dearing, mal silné cytotoxické účinky na všetky testované línie s výnimkou normálnych l‘udských fobroblastov. Dokázali sme synergické cytotoxické pôsobenie reovírusu s cytostatikami. Tento objav sa zdá nádejný pre klinickú prax.
Záverom možno zhrnúť, že sme zvládli prácu s týmto vírusom a zaviedli modely umožň ujúce overiť účinnosť jeho kombinácie s cytostatikami. Ďalej plánujeme študovať potenciáciu stimulácie imunity a posúdiť vplyv inaktivujúci protivírusovú imunitu vrátane pokusov na zvieratách.

Práca vznikla za finančnej podpory GA ČR 301/05/2240
a MŠMT výskumné zámery č.0021620813.

Literatura:

1. Alain T, Hirasawa K, Pon JK (2002): Reovirus therapy of lymphoid malignancies. Blood, 1000: 41464153
   
2. Mullen JT a Tanabe KK (2002): Viral Oncolysis. The Oncologist, 7:106-119
   
3. Norman KL, Coffey MC, Hirasawa K et al (2002): Reovirus oncolysis of human breast cancer. Hum Gen Ther, 13:641-652
   
4. Tyler,K.L., Fieleds, B.N. (1996): Reoviruses, p15971623, in Fileds Virology, Philadelphia, Lippincot-Raven.
   
5. Wilcox ME, Yong W, Senger D et al (2001): Reovirus as an oncolytic agent against experimental human malignant gliomas. J. Natl. cancer inst., 13: 903912
   
6. Wildner O (2003): Comparison of replication-selective, oncolytic viruses for the treatment of human cancers. Curr Opin Mol Ther.,5: 351361
   
7. Yang WQ, Senger D, Muzik H et al. (2003): Reovirus prolongs survival and reduces the frequency of spinal and leptomengeal metastase from medulloblastoma. Cancer Res, 63:31623172