Úloha p38 kinázy v expresi ABC transportérů zodpovědných za MDR

Léčba nádorových onemocnění bývá často komplikována selekcí klonu rakovinných buněk rezistentního nejen k používanému chemoterapeutiku, ale obvykle i k řadě dalších léčiv. Jedním z mechanizmů vzniklé multilékové rezistence (multi drug rezistence – MDR) je zvýšená exprese transportních molekul vázajících ATP, nebo-li ABC transportérů (ATP-binding cassette) (Gottesman et al. 1995). U savců jsou s MDR nejčastěji spojeny tři typy transportérů – MDR1/ABC B1/Pgp, MRP1/ABC C1 a BCRP/ABC G2 (shrnuto v Li et al. 2007). Původní rolí těchto transportérů je obrana organizmu proti cytotoxickým látkám, proto je jejich exprese hojná u kmenových a méně diferencovaných buněk. Většina nádorů pochází právě z nediferencovaných nebo dediferencovaných buněk.

Nedávno bylo zjištěno, že exprese ABC transportérů může být pozitivně regulována kinázami aktivovanými mitogeny (MAPK), zvláště p38 a ERK MAPK (Katayama et al. 2007). Třídenní inkubace buněk A549 v prostředí obsahujícím interferon alfa (IFN) vedla k zvýšení exprese všech tří základních typů ABC transportérů. Působení IFN vedlo také k zvýšení exprese p38 MAPK a STAT1 (Krejčová et al. 2009). Cílem této práce bylo tedy experimentálně prokázat zapojení p38 MAPK do regulace exprese ABC transportérů pomocí farmakologického inhibitoru p38 MAPK a pomocí buněčné linie neexprimující p38 MAPK. Modelová buněčná linie A549, exprimující velké množství ABC transportérů byla derivována z lidského nemalobuněčného nádoru plic. Stimulace p38 MAPK byla provedena pomocí IFN (1500 U/ml). K inhibici kinázy p38 byl použit inhibitor SB203580 (20 µM, SB). Paralelním modelem jsou myší embryonální kmenové buňky s wt p38 (ES p38+/+) nebo ES s mutovaným genem pro p38 (ES p38–/–). JC1 (0,25 µg/ml) je substrátem pro MDR1, v námi používané koncentraci emituje v FL-1. Calcein AM (0,2 µM) je substrátem MDR1 a MRP1 a po jeho vstupu do cytoplazmy dochází k štěpení molekuly činností nespecifických esteráz za vzniku zelené fluorescence. Substrátem BCRP jsou barviva BODIPY-prazosin (0,5 µM; emituje záření v FL-1), pheophorbid a (1 µM; emituje záření v FL-4) a Hoechst33342 (5 µg/ml) UV excitace – emise v FL-1). Barvení živých buněk probíhalo 10 minut v 37°C (Krejčová et al. 2009). Pro ověření specificity reakce jsme používali farmakologické inhibitory transportních proteinů Cyclosporin D (50 µM, CSD – MDR1); MK571 (20 µM, MK – MRP1); Fumitremorgin C (20 µM, FTC – BCRP); Cyclosporin A (50 µM, CSA – nespecifický inhibitor transportérů).

Inkubace buněk A549 s IFN vedla ke snížení barvitelnosti buněk všemi metodami, což ilustruje zvýšení exprese ABC transportérů. Přidání inhibitoru p38 MAPK SB vedlo pak k částečnému zvýšení barvitelnosti, tj. snížení exprese ABC transportérů. Jestliže byly buňky kultivovány jen v přítomnosti SB, jejich barvitelnost byla vyšší než u kontrol, došlo tedy i k snížení bazální exprese ABC transportérů. Studie byla paralelně vedena i na buňkách ES, které i bez ovlivnění exprimují velké množství ABC transportérů (Apáti et al. 2008). Pomocí všech použitých fluorescenčních substrátů jsme prokázali, že ES buňky p38–/– jsou barvitelnější než ES buňky p38+/+, což znamená, že exprimují méně ABC transportérů. Stejně tak ES p38+/+ kultivované v přítomnosti inhibitoru p38 MAPK SB exprimovaly méně ABC transportérů. Zdá se tedy, že na základě našich výsledků je možné usuzovat na přímou souvislost mezi p38 kinázou a expresí ABC transportérů odpovědných za MDR.

Kontakt: jipro@sci.muni.cz

Literatura:

1. Apáti A, Orbán TI, Varga N, Németh A, Schamberger A, Krizsik V, Sarkadi B. et al. (2008) High level functional expression of the ABCG2 multidrug transporter in undifferentiated human embryonic stem cells. Biochim Biophys Acta 1778(12):2700-9
2. Gottesman MM, Hrycyna CA, Schoenlein PV, Germann UA, Pastan I (1995). Genetic analysis of the multidrugtransporters. Annu Rev Genet;29: 607–49.
3. Katayama K, Yoshioka S, Tsukahara S, Mitsuhashi J, and Sugimoto Y (2007). Inhibition of the mitogen-activated protein kinase pathway results in the down-regulation of P-glycoprotein. Mol Cancer Ther;6(7):2092-2101
4. Krejčová D, Procházková J, Kubala L, Pacherník J (2009). Modulation of cell proliferation and differentiation of human lung carcinoma cells by the interferon-alpha. Gen Physiol Biophys (v tisku)
5. Li F, Tiede B, Massagué J, Kang Y (2007). Beyond tumorigenesis: cancer stem cells in metastasis. Cell Research 17: 3-14

Projekt byl podpořen graty GAČR 301/08/0717, AVOZ 50040507, AVOZ 50040507702.