ÚLOHA RAD51-BRCA2 INTERAKCIE V UDRŽOVANÍ STABILITY GENÓMU: MECHANIZMUS ZOSTAVENIA A STABILIZÁCIE RAD51 PRESYNAPTICKÉHO FILAMENTU AKO POTENCIÁLNY CIEĽ PROTINÁDOROVEJ TERAPIE?

Východiská:

Pre nádorové bunky je príznačná výrazná genómová nestabilita spojená s kumuláciou genetických alterácií, preto terapeuticky vyvolané DNA poškodenie dokáže znížiť ich životaschopnosť. Často však dochádza k vývinu rezistencie. Homologická rekombinácia je mechanizmus zodpovedný za presnú opravu DNA dvojreťazcových zlomov (DSBs) – vážneho typu DNA poškodenia. Medzi kľúčové proteíny, ktoré sa jej zúčastňujú, patria RAD51 a BRCA2. Mutácie v géne BRCA2 sú spojené so vznikom karcinómu prsníka, ovária a prostaty. BRCA2 viaže RAD51 cez BRC motívy (BRC1-8) a C-terminálnu doménu, exón 27 (Ex27), kde TR2-peptid predstavuje minimálnu aktívnu časť. Cieľom našej práce bola identifikácia a charakterizácia RAD51 mutantu s narušenou Ex27-interakciou, bližšie objasnenie úlohy interakcie RAD51-BRCA2(Ex27) pri udržiavaní stability genómu a možného využitia jej narušenia pre liečbu malignít.

Materiál a metódy:

Porušenie RAD51-BRCA2(Ex27) interakcie u mutantu bolo overené dvojhybridným systémom a „pull-down“ experimentmi. Mutanty boli fenotypizované in vivo v myších embryonálnych kmeňových bunkách (mESCs). Účinok TR2 na stabilitu RAD51 filamentu bol sledovaný pomocou metódy EMSA (electrophoretic mobility shift assay). Pre meranie rýchlej reakčnej kinetiky bola využitá metóda stopped-fl ow.

Výsledky:

V partnerskom laboratóriu bol identifikovaný mutant RAD51 defektný v interakcii s Ex27. Mutant in vivo nemal výrazný vplyv na proliferizáciu a stratu heterozygotnosti u mESCs (na rozdiel od RAD51KR – mutanta neschopného hydrolýzy ATP), avšak zvyšoval senzitivitu mESCs voči camptothecínom vyvolanému DNA poškodeniu (mj. DSBs). TR2 in vitro chráni RAD51 filamenty pred destabilizujúcim účinkom BRC3, ale zvýšenie stability voči disociácii pri nadbytku voľnej ssDNA bolo menej výrazné, čo sme potvrdili metódou stopped-fl ow, ktorá zároveň odhalila zmenu mechanizmu zostavenia filament pri pre-inkubácii RAD51 s TR2. RAD51 mutant defektný v interakcii s Ex27 tieto zmeny takmer nevykazoval.

Záver:

Narušenie interakcie RAD51-BRCA2(Ex27) zvyšuje citlivosť voči DNA poškodeniu bez výrazného cytotoxického účinku na nepoškodzované bunky. Za tento efekt je pravdepodobne zodpovedné porušenie Ex27-závislej koordinácie tvorby a biologickej stabilizácie RAD51 filamentu (spôsob vytvárania nukleačných jadier, ochrana pred antirekombinačnými proteínmi) manifestujúce sa až po preťažení bunky DNA poškodením. Inhibícia RAD51-BRCA2(Ex27) interakcie by teda mohla byť využiteľná pri liečbe napr. rádiorezistentných nádorov.

Práca bola podporená grantovým projektom GACR13-26629S a GACR207/ 12/ 2323.