Vplyv hypoxie na chemorezistenciu a zmeny bunkového cyklu neuroblastómových bunkových línií.

Hypoxia v nádorovom tkanive významne koreluje s rozsahom rakovinového ochorenia a jeho horším klinickým priebehom. Toto je sčasti spôsobené hypoxiou-indukovanou rezistenciou k rádioterapii a chemoterapii, genómovou instablitou a indukciou angiogenézy (Axelson et al. 2005). Zatiaočo mechanizmus hypoxiou navodenej rádiorezistencie je pomerne dobre charakterizovaný, mechanizmus ovplyvňujúci chemorezistenciu vyvolanú hypoxickým fenotypom dodnes ostáva neúplne objasnený (Moeller BJ and Dewhirst MW 2006). Hypoxiou indukovaný transkripčný faktor (HIF) je hlavný transkripčný faktor aktivovaný poklesom parciálneho tlaku kyslíka v mikroprostredí. Je tvorený dvoma podjednotkami ARNT/HIF-1a a hypoxiou indukovanou HIF-1á s homológami HIF-2a a HIF-3a (Semenza 2005). HIF-1a riadi transkripciu mnohých génov, ktoré kódujú proteíny zahrnuté v angiogenéze, metabolizme glukózy, proliferácii buniek, bunkovom prežívaní, invázii a vzniku metastáz. Nadmerná expresia HIF-1a je spájaná so zlyhaním liečby a zvýšenou úmrtnosťou. Jednou z príčin zníženej cytostatikami navodenej apoptózy a klonogénnej rezistencie je depriváca kyslíku. V literatúre sa predpokladá, že hypoxiou navodená rezistencia na cisplatinu a doxorubicínin vitro vzniká aktiváciou HIF kaskády, pretože je možné ju zvrátiť posttranskripčným blokovaním génu pre HIF-1a (Brown et al. 2006).
Primárnym cielom našej štúdie bolo určiť význam a vplyv hypoxie (a expresie HIF-1a génu) na citlivosť bunkových kultúr odvodených od neuroblastómu (NBL), (UKF-NB3, UKF-NB4 a rezistentných na cisplatinu UKF-NB3^cddp, UKF-NB4^cddp) voči cisplatine a jej derivátu karboplatine. Ďalej sme na daných líniách chceli sledovať zmeny bunkového cyklu a apoptózu v normoxických a hypoxických podmienkach.
Na indukciu hypoxických podmienok v in vitro podmienkach sme bunkové kultúry kultivovali v zatvorenom systéme (Hypoxic chamber, Billups-Rothenberg, Inc., USA) s definovanou zmesou plynov O2 (1-2 %), CO2 (5 %), N2 (93-94 %). Hypoxický fenotyp testovaných buniek sme overili kontrolou expresie proteínu HIF-1a pomocou Western blotu s králičou polyklonálnou protilátkou (Upstate Biochemicals). IC50 jednotlivých cytostatík sme vypočítali z výsledkov 96 jamkových MTT testov preložením nelineárnej regresnej krivky (software GraphPad Prism4). Analýzu bunkového cyklu sme honotili na prietokovom cytometri (FACSCalibur) po farbení propídium jodidom. Apoptózu sme merali pomocou prietokovej cytometrie ako hypodiploidný peak a výsledky potvrdili skúmaním zmien morfológie bunkového jadra pomocou fluorescenčného mikroskopu.
U všetkých neuroblastómových línií sa v hypoxických podmienkach chemorezistencia značne zvýšila. Nárast chemorezistencie indukovanej hypoxiou sa ale sčasti javí byť závislý na type buniek. Chemorezistencia línie UKF-NB4, predstavujúcej S-typ neuroblastómu, bola za hypoxických podmienok vyššia než u tej istej línie s in vitro navodenou rezistenciou na cisplatinu, UKF-NB4^cddp. Naopak, u N-typu neuroblastómu, UKF-NB3 bunkovej línii a jej rezistentného klonu, je v normoxických i hypoxických podmienkach chemorezistencia na použité cytostatiká vždy vyššia u rezistentnej línie, UKF-NB3^cddp. Hypoxiou indukovanú rezistenciu sme čiastočne zvrátili funkčnou inhibíciou HIF chetomínom. Chetomín inhibuje väzbu HIF s p300, ktorá spúšťa hypoxiou indukovanú transkripciu.
Vo všetkých skúmaných bunkových líniách za hypoxických podmienok došlo k redukcii proliferačnej frakcie (S+G2/M fáza) v porovnaní s normoxickou kontrolou, a takisto u všetkých došlo k poklesu percenta apoptotických buniek po podaní derivátov platiny.
Naša pilotná štúdia poukazuje na pokles chemosenzitivity nádorových buniek za hypoxických podmienok, ktoré sú častým sprievodným javom malígnych nádorov in vivo. Preto sa in vitro testovanie nových protinádorových terapeutík v hypoxických podmienkach zdá byť nevyhnutné.

Bibliografia:

1. Axelson H et al. Hypoxia-induced dedifferentiation of tumor cells a mechanism behind heterogeneity and aggressiveness of solid tumors. Semin Cell Dev Biol. 2005;16(4-5):554-63.
   
2. Brown LM et al. Reversing hypoxic cell chemoresistance in vitro using genetic and small molecule approaches targeting hypoxia inducible factor-1. Mol Pharmacol. 2006;69(2):411-8.
   
3. Moeller BJ and Dewhirst MW. HIF-1 and tumour radiosensitivity. Br J Cancer. 2006;95(1):1-5.
   
4. Semenza GL. Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2003;3(10):721-32.

Práca vznikla za finančnej podpory MŠMT VZ č. 0021620813.