Konference: 2005 1. ročník Dny diagnostické, prediktivní a experimentální onkologie
Kategorie: Onkologická diagnostika
Téma: 02. Nové technologie v diagnostice, programování a predikci odpovědi nádorů v terapii
Číslo abstraktu: 010
Autoři: Mgr. Marta Dziechciarková, Ph.D.; doc. MUDr. Marián Hajdúch, Ph.D.; RNDr. Radek Trojanec, Ph.D.; Mgr. Jitka Berkovcová, Ph.D.
Laserová mikrodisekce (LCM) je rychlá a
spolehlivá metoda která umožňuje isolaci cílových buněk ze
specifického komplexu tkáně pro jejich následnou molekulární nebo
proteinovou analýzu. Základem LCM je inverzní mikroskop se
zabudovaným nízko výkonnostním infračerveným laserem. Nařezané
tkáně jsou upevněny na standardní podložní sklíčko a termoplastická
membrána je umístěna nad dehydratovaný preparát. Ohniskem
laserového mikroskopu se aktivuje termoplastická membrána která je
navázána k identifikované cílové buňce v mikroskopované části
preparátu. Laser roztaví termoplastickou fólii v daném místě, kde
je navázaná cílová buňka. Laserová mikrodisekce byla použita pro
isolaci buněk u řady typů buněčných i tkáňových preparátů, včetně
zamražených vzorků, formalínem fixovaných, parafinizovaných tkání
či cytologických preparátů. V závislosti na použitém materiálu z
mikrodisekovaných buněk je možno extrahovat DNA, mRNA či proteiny v
dobré kvalitě. Kombinací s dalšími technikami, jako například cDNA
microaarays, by LCM měla pomoci identifikovat nové diagnostické a
prognostické markery vedoucí ke zlepšení diagnosticko
terapeutických metod v léčbě onkologických onemocnění.
Laserovou mikrodisekcí byly isolovány na našem pracovišti buňky z cytologických preparátů karcinomů plic získaných punkční cytologií (barveno metodou Giemsa-Romanowsky), zamražených či parafinizovaných nádorových tkání (barveno hematoxylinem) a stabilní buněčné linie K562 (barveno neutrální červení). Našim metodickým cílem bylo zavést kombinaci LCM s lineární amplifikací DNA pro účely dalších genetických analýz z biologického materiálu s minimálním obsahem nádorových buněk, či pro studium nádorové heterogenity na jednobuněčné úrovni.
Buňky nasbírané pomocí LCM byly v mikropodmínkách lyzovány proteinázou K a DNA byla uvolněná do roztoku. Po tepelné inaktivaci proteinazy K, byla dvoušroubovice DNA rozštěpena restrikčním enzymem MseI a na rozštěpené konce byly navázány adaptéry se specifickými sekvencemi. Pomocí těchto sekvencí byla DNA následně amplifikována v PCR reakci. Tento primární produkt byl následně použit pro další genetické analýzy, např. komparativní genomickou hybridizaci z jedné buňky nebo amplifikaci a sekvenování exonů 19 a 21 EGFR1 receptoru pro predikci účinnosti nízkomolekulárních EGFR1 inhibitorů.
Naše zkušenosti potvrzují použitelnost této nové technologie pro rutinní isolaci cílových buněk za účelem amplifikace DNA pro další (cyto)genetické analýzy. Práce na tomto projektu je podporována granty MSM6198959216, IGA MZCR NC 7495-3 a MPO 1H-PK/45.
Laserovou mikrodisekcí byly isolovány na našem pracovišti buňky z cytologických preparátů karcinomů plic získaných punkční cytologií (barveno metodou Giemsa-Romanowsky), zamražených či parafinizovaných nádorových tkání (barveno hematoxylinem) a stabilní buněčné linie K562 (barveno neutrální červení). Našim metodickým cílem bylo zavést kombinaci LCM s lineární amplifikací DNA pro účely dalších genetických analýz z biologického materiálu s minimálním obsahem nádorových buněk, či pro studium nádorové heterogenity na jednobuněčné úrovni.
Buňky nasbírané pomocí LCM byly v mikropodmínkách lyzovány proteinázou K a DNA byla uvolněná do roztoku. Po tepelné inaktivaci proteinazy K, byla dvoušroubovice DNA rozštěpena restrikčním enzymem MseI a na rozštěpené konce byly navázány adaptéry se specifickými sekvencemi. Pomocí těchto sekvencí byla DNA následně amplifikována v PCR reakci. Tento primární produkt byl následně použit pro další genetické analýzy, např. komparativní genomickou hybridizaci z jedné buňky nebo amplifikaci a sekvenování exonů 19 a 21 EGFR1 receptoru pro predikci účinnosti nízkomolekulárních EGFR1 inhibitorů.
Naše zkušenosti potvrzují použitelnost této nové technologie pro rutinní isolaci cílových buněk za účelem amplifikace DNA pro další (cyto)genetické analýzy. Práce na tomto projektu je podporována granty MSM6198959216, IGA MZCR NC 7495-3 a MPO 1H-PK/45.
Datum přednesení příspěvku: 9. 12. 2005
