Využití MTT-testu ke zjištění reaktivity pacienta na podávaná cytostatika

Úvod

V posledním desetiletí došlo k výraznému zkvalitnění protinádorové léčby. Zavedení nových léčebných postupů (např. léčba biologická) umožňuje přechod od léčby empirické k léčbě kauzální, která může být individuálně nastavena dle celkového stavu pacienta, jeho funkční zdatnosti a závažnosti nádorového onemocnění. Cytostatika ovlivňují jak nádorové tak normální buňky organismu. Záleží pouze na vnímavosti buněk k danému cytostatiku, aby se projevila jeho cytotoxicita. Tuto vnímavost lze sledovat pomocí testů vitality buněk. Tyto testy povětšinou sledují schopnost buněk získávat energii oxidačním metabolizmem. Pokud je buňka poškozena, ztrácí tuto vlastnost. Cílem práce bylo ověření předpokladu, zeje možné pomocí testů vitality (MTT testů), zjistit citlivost buněk pacienta k podávanému cytostatiku. A ze zjištěných hodnot upravit schéma léčebného postupu.

Soubor nemocných a metodika

Do pilotní studie byly zařazeny vzorky 2 nemocných s metastazujícím nádorovým onemocněním a 2 zdravých kontrol. Jednalo se o 53-letého nemocného s metastazujícím konvenčním renálním karcinomem do plic, který byl ve druhé linii léčený sunitinibem, dále se jednalo o 64-letou nemocnou s generalizovaným karcinomem močového měchýře, která byla léčena paliativní chemoterapií v kombinaci gemcitabin, karboplatina. Odběr byl proveden do zkumavek s heparinem. Z těchto vzorků byly pomocí separace na hustotním gradientu sacharosy odseparovány granulocyty, které byly použity do jednotlivých testů.

Metody

• Stanovení metabolické aktivity granulocytů (MTT - test)
  
  Žlutý MTT (3-[4,5-dimetylthiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium bromid) se mitochondriálními enzymy dýchacího řetězce redukuje na fialový formazanový derivát, který zůstává uvnitř buněk ve formě nerozpustných granulí. Po přidání detergentu SDS a okyselení se barvivo z buněk uvolní a rozpustí, takže vznikne čirý roztok vhodný k fotometrickému stanovení.
• 
  
• Stanovení a ověřování počtu a životnosti odseparováných buněk
  
  Pro stanovení počtu granulocytů bylo zvoleno počítání buněk v Bůrkerově komůrce. Po 20-ti násobném zředění počítané suspenze Tůrkerovým roztokem se počítá počet jednotlivých elementů v 50-ti středních čtvercích.
• 
  
• Separace na hustotním gradientu
  
  Separace buněk na hustotním gradientu využívá rozdílné hustoty krevních elementů, které jsou zachytávány podlé své hustoty na hustotním gradientu.

Výsledky

Při stanovení metabolické aktivity granulocytů a lymfocytů vystavených působení cytostatika, bylo zjištěno, že u obou nemocných s nádorovým onemocněním dochází k výraznému poklesu hodnoty absorbance vznikajícího formazánu.

Graf 1: Srovnání hodnot metabolických aktivit u lymfocytů, vystavených působení daného cytostatika.

Závěr

U nemocné s generalizovaným karcinomem močového měchýře byla prokázána vysoká citlivost na gemcitabin. Pro intoleranci byla následně tato léčba ukončena a došlo ke změně léčebného režimu. Vysoká citlivost k sunitinibu byla prokázána i u 53-letého pacienta s generalizovaným karcinomem ledviny. Při terapeutické dávce 50 mg bylo dosaženo parciální remise plicních metastáz, nemocný měl však při léčbě opakovaně projevy závažné toxicity léčby. Na základě výsledku MTT testu byla terapeutická dávka snížena na 25 mg, kterou nemocný dobře toleruje. Po aplikaci 6 cyklů chemoterapie bylo dosaženo kompletní regrese nálezu na plicích při dobré toleranci stanovené dávky.

Tato studie byla podpořena výzkumným záměrem VZMSM 0021620819.