Zistenie prítomnosti hypermetylácie v promótorovej oblasti HPV16 v cervikálnych skvamóznych intraepiteliálnych léziách

Úvod:

DNA metylácia je epigenetický mechanizmus na reguláciu génovej expresie. Bolo dokázané, že DNA metylácia je tiež dôležitá regulačná dráha v modulácii génovej expresie ľudského papilomavírusu (HPV). DNA metylácia najčastejšie ovplyvňuje dlhú kontrolnú oblasť HPV, ktorá obsahuje promótor P97 a enhancer špecifický pre epiteliálne bunky. Tieto oblasti obsahujú niekoľko väzobných miest pre bunkové transkripčné faktory a pre proteín E2, ktorý reguluje vírusovú transkripciu. E6 a E 7 gény HPV 16 sú práve prepisované z promótora P97 a ich kontinuálna expresia je nevyhnutná pre malígnu progresiu a pre udržanie transformovaného fenotypu. V tejto štúdii sme zisťovali prítomnosť metylácie v promótorovej oblasti HPV16 pomocou modifikácie DNA s bisulfidom sodným a pyrosekvenácie a tiež sme zisťovali počet kópií E6 mRNA transkriptov.

Materiál a metódy:

Hypermetyláciu promótorovej oblasti sme zisťovali v bunkovej línii odvodenej od karcinómu krčka maternice a u 45 cervikálnych vzoriek pozitívnych na HPV16 infekciu. Vyšetrili sme 18 vzoriek s diagnózou nízkostupňová skvamózna intraepiteliálna lézia (low-grade squamous intraepithelial lesion – LSIL), 23 vzoriek s vysokostupňovou skvamóznou intraepiteliálnou léziou (high-grade squamous intraepithelial lesion – HSIL) a štyri vzorky s invazívnym skvamóznym karcinómom (SCC). Extrahovaná DNA bola modifikovaná bisulfidom sodným, amplifikovaná v PCR a hypermetylácia promótorovej oblasti u HPV16 bola analyzovaná pyrosekvenáciou. V E 6 mRNA kvantifikácii sme využili plazmidovú DNA s klonovaným E6 fragmentom z Caski bunkovej línie.

Výsledky:

Z piatich vyšetrovaných CpG ostrovčekov v HPV16 promótorovej oblasti (nt31, 37, 43, 52 a 58) bola metylácia nájdená u všetkých piatich nukleotidov v bunkovej línii Caski a u SCC. Metylácia CpG ostrovčekov bola tiež nájdená v 65,6 % LSIL a 90,4 % HSIL lézií. Percento metylácie bolo vyššie u HSIL, ale tento rozdiel nebol štatisticky významný, okrem nukleotidu nt58 (p=0,03419). Medzi typom cervikálnej lézie a množstvom E6 mRNA kópií nebol tiež zistený významný rozdiel. Záver: Existuje viacero hypotéz o prítomnosti hypermetylácie v promótorovej oblasti HPV16 a jej asociácii k expresii E6/E7 mRNA . Potvrdili sme fakt, že metylácia promótorovej oblasti HPV16 je v klinických vzorkách bežný fenomén, ktorý môže pôsobiť podobne ako obranný mechanizmus hostiteľskej bunky. V budúcnosti by bolo potrebné rozšíriť súbor klinických vzoriek a vyšetriť aj fyzický stav HPV16, lebo sa predpokladá, že pri integrovaných kópiách HPV16 je pravdepodobnejšia možnosť progresie cervikálnej lézie na karcinóm.

Poďakovanie: Táto štúdia bola podporená projektami ITMS 26110230067 „Zvýšenie možností kariérneho rastu vo výskume a vývoji v oblasti lekárskych vied“ a ITMS 26220220113 „Molekulová diagnostika rakoviny krčka maternice“, ktoré sú spolufinancované zo zdrojov EÚ.