Změny obsahu metalothioneinu v séru pacientů s nádorovým onemocněním.

Klíčová slova
Metalothionein; krevní sérum; elektrochemické stanovení; nádorová onemocně ní; nádorový marker

Úvod
Národní onkologický registr České republiky poskytuje cenné informace o nově diagnostikovaných případech zhoubných onemocnění [1,2]. V roce 2003 bylo nahlášeno 66 637 nových případů zhoubných novotvarů a nádorů in situ (dg. C00-C97 a D00D09 dle 10. revize MKN). Incidence onemocnění (absolutní i relativní počty) u mužů je v současnosti jen nepatrně vyšší než u žen. Dlouhodobě u obou pohlaví incidence zaznamenává rostoucí trend. Počet nově hlášených případů v roce 2003 byl u žen téměř dvojnásobný než v roce 1975 [1]. Incidence zhoubných nádorů (ZN) u mužů narůstala pomaleji, mezi roky 1975 a 2003 se relativní ukazatel zvýšil o 80 %. Tempo nárůstu incidence novotvarů je plynulé a ani data pro rok 2003 nenaznačují zvrat v tomto vývoji. Absolutní počet zemřelých v roce 2003 narostl na 29 195 (16 208 mužů a 12 987 žen), což je 26,2 % z celkového počtu zemřelých v ČR. Podle statistik jsou jednou z nejčastějších onkologických diagnóz zhoubné nádory trávicího ústrojí, zejména kolorekta (dg. C18 až C21). Přes zmíněné pozitivní změny snížení standardizovaného počtu onemocnění Česká republika zaujímá těsně za Maďarskem druhou příčku v pomyslném žebříčku nejvyšší úmrtnosti na dg. C18 až C21 v Evropě. Jako pozitivní lze označit vývoj rakoviny děložního hrdla (dg. C53). Nově hlášené případy zhoubných onemocnění se týkají především osob starších 60ti let. Zhoubné nádory u žen jsou v úhrnu diagnostikovány v mladším věku než u mužů, neboť některé diagnózy jsou početné už ve věkové skupině 30-59 let [1,3]. Cílem naší práce je studium obsahu metalothioneinu (MT) u pacientů se zhoubnými nádory. Metalothioneiny patří do skupiny intracelulárních, nízkomolekulárních na cystein bohatých proteinů o molekulové hmotnosti od 6-10 kDa [4-11]. Je pravděpodobné, že změny v expresi MT mohou být prognostickým markerem u celé řady zhoubných nádorových onemocnění [12]. Nadměrná exprese MT je spojena s maligními nádory a je studována jako nový prognostický marker v progresi onemocnění, přežití pacientů, korelací s histologickým typem nádoru a nádorovým gradingem [5].

Materiál a Metody

Klinický materiál
V průběhu roku 2005 byla získána séra od pacientů léčených pro zhoubný nádor na různých odděleních FN Motol (Radioterapeutické oddělení dospělí, Kožní oddělení a III. chirurgická klinika 1. LF UK). Pokud to bylo možné, byly sledovány základní biochemické ukazatele (ALP, AST, ALT, GMT a nádorový marker CA 15-3). Krevní séra byla ihned zmražena na –20°C do doby jejich dalšího ;zpracování. Celkem bylo analyzováno 80 sér pacientů; z toho pro zhoubný nádor tlustého střeva n = 9 s průměrným věkem 55 roků; melanom n = 4 s průměrným věkem 59,5 roku; zhoubný nádor prsu n = 14 s průměrným věkem 51,5 roku; zhoubný nádor plic n = 12 s průměrným věkem 62 roků; zhoubný nádor štítné žlázy n = 12 s průměrným věkem 57 roků; zhoubný nádor ledviny n = 7 s průměrným věkem 31 roků; lymfoidní leukémii n = 18 s průměrným věkem 19 roků; a zhoubný nádor jícnu n = 4 s průměrným věkem 55,5 roku.

Biochemická analýza
Hladiny vybraných jaterních enzymů ALP (S-alkalická fosfatasa), AST (S-aspartátamino-transferasa), ALT (S-alaninaminotransferasa) a GMT (S-ă-glutamyl-transferasa) byly analyzovány spektrofotometricky na automatickém biochemickém analyzátoru Advia 1650 (Bayer, Tarrytown USA) za využití setu Bayer při 37°C. Množství nádorového markeru CA 15-3 bylo stanoveno na analyzátoru Centaur (Bayer, Tarrytown, USA) imunochemiluminiscenční metodou.

Příprava vzorků pro elektroanalytické stanovení metalothioneinu
Ze získaných vzorků krevních sér bylo odebráno 100 µl a umístěno na 15 min. při 99°C do termobloku (Eppendorf 5430, USA). Poté byly vzorky ochlazeny na 4°C a centrifugovány při 4°C, 15 000 gpo dobu 30 min. (Eppendorf 5402, USA). Metalothioneiny patří k termostabilním proteinům, které zůstávají přítomné v roztoku i po jeho tepelné denaturaci [13-17]. Takto připravené vzorky byly analyzovány námi upraveným postupem adsorptivní přenosové techniky (AdTS) s diferenční pulsní voltametrií (DPV) [18]. Množství analyzovaného vzorku bylo 5 µl.

Elektroanalytické stanovení metalothioneinu pomocí Brdičkovy reakce metodou AdTS DPV
Vzorky byly analyzovány na přístroji AUTOLAB Analyser (EcoChemie, Netherlands) ve spojení s VA-Stand 663 (Metrohm, Switzerland) v klasickém tříelektrodovém uspořádání. Pracovní elektrodou byla visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) s plochou kapky 0,4 mm² referenční elektrodou byla Ag/AgCl/3M KCl a pomocnou grafitová elektroda. Základní elektrolyt (1 mmol.dm^-3 Co(NH3)6Cl3 a 1 mol.dm^-3 amonný pufr NH3(aq) + NH4Cl (Sigma Aldrich, ACS), pH = 9,6) byl po každých 5 analýzách vyměněn [15]. AdTS DPV parametry byly následující: čas akumulace 120 s, počáteční potenciál –0,6 V, konečný potenciál -1,6 V, modulační čas 0,057 s, časový interval 0,2 s, potenciálový krok 1,05 mV/s, modulační amplituda 250 mV, E_ads = 0 V, teplota 0°C [15].

Výsledky a diskuse
V práci byly popsány pilotní experimentální výsledky stanovení obsahu metalothioneinu u pacientů se zhoubnými nádory. Vzorky krevních sér byly odebírány v průběhu roku 2005, a pokud to bylo možné, byly charakterizovány z hlediska základních biochemických ukazatelů [15]. U většiny pacientů nebyl pozorován výrazný vzestup hladiny jaterních enzymů (ALP, AST, ALT a GMT). Analýza MT byla provedena námi modifikovaným elektroanalytickým postupem (diferenční pulzní voltametrie v kombinaci s adsorptivní přenosovou technikou). Pro tento účel bylo využito analýzy pomocí Brdičkovy reakce [20]. Každý vzorek krevního séra byl nejdříve tepelně denaturován a po centrifugaci byl odebraný supernatant použit pro analýzu MT. Pro určení obsahu MT ve vzorku bylo využito metody standardního přídavku. Získali jsme velmi dobrou lineární závislost standardního přídavku metalothioneinu na zvyšující se koncentraci (y = 7177,7x + 7939,3; R2 = 0,9925) [15,19]. Pro určení hladiny MT zdravých lidí jsme získali krevní sérum dárců krve. V těchto námi testovaných vzorcích lidského séra byla zjištěna průměrná koncentrace MT 0,62 ± 0,02 µM (n = 5). Zjistili jsme, že u pacientů s nádory prsu byl průměrný obsah MT 1,57 µmol.dm^-3, přičemž u devíti pacientů překročila hladina MT 1 µmol.dm^-3 (64%) a u tří byla hladina MT vyšší než 2 µmol.dm^-3. (21%). V případě pacientů s melanomem byla průměrná hladina MT 1,97 µmol.dm^-3. , u 3 pacientů byl obsah MT vyšší než 1 µmol.dm^-3 (75%) a u 2 pacientů přesáhla hladina MT 2 µmol.dm^-3 (50%).

Obr. 1.
(A) Schéma adsorptivní přenosové techniky
(1) vytvořená pracovní elektroda
(2) adsorpce vzorku na povrch elektrody
(3) oplach elektrody, odstranění nadbytečného množství vzorku
(4) analýza.
(B) Diferenční pulzní voltamogram základního elektrolytu (– – –) a 10 µmol.dm^-3. MT po 120 s akumulace na povrch pracovní elektrody.

U pacientů se zhoubným nádorem tlustého střeva byla průměrná hladina MT 3,2 µmol.dm^-3 , tedy 2 krát vyšší než u pacientů s nádorem prsu. Obsah MT vyšší než 1 µmol.dm^-3 byl pozorován u 8 pacientů (88 %), u 3 byla hladina MT vyšší než 2 µmol.dm^-3 (33 %) a u 2 pacientů (22 %) se hladina sérového MT pohybovala nad hodnotou 4 µmol.dm^-3. V případě pacientů se zhoubným nádorem plic byl průměrný obsah MT 2,54 µmol.dm^-3, u 8 pacientů byl obsah MT vyšší než 1 ěmol.dm^-3(66 %), u 6 pacientů přesáhla hladina MT 2 µmol.dm^-3 (50 %) a v případě 2 pacientů byl obsah MT vyšší než 4 µmol.dm^-3 (16 %). U pacientů se zhoubným nádorem štítné žlázy byl průměrný obsah MT 2,11 µmol.dm^-3 , přičemž u osmi pacientů přesáhla hladina MT 1 µmol.dm^-3 (66 %), u čtyřech byla hladina MT vyšší než 2 µmol.dm^-3 (33 %) a u dvou pacientů překročila hladina MT 4 µmol.dm–3 (16 %). Průměrná hladina sérového MT pacientů se zhoubným nádorem ledvin činila 1,82 µmol.dm^-3, u 5 pacientů přesáhl obsah MT 1 µmol.dm^-3 (71 %) a u 2 byla hladina MT vyšší než 2 µmol.dm^-3 (28 %). U pacientů trpících lymfoidní leukémií byl průměrný obsah MT 2,29 µmol.dm^-3, u 13 byl obsah MT vyšší než 1 µmol.dm^-3 (72 %), u 8 pacientů přesáhla hladina MT 2 µmol.dm^-3 (44 %) a v případě 4 pacientů překročil obsah MT hodnotu 4 µmol.dm^-3 (22 %). V případě pacientů s diagnostikovaným zhoubným nádorem jícnu byla průměrná hladina MT 2,32 µmol.dm^-3, přičemž u 2 pacientů překročila hladina MT 1 µmol.dm^-3 (50 %), u 1 pacienta byla hladina MT vyšší než 2 µmol.dm^-3 (25 %) a u 1 pacienta přesáhla hladina MT 4 µmol.dm^-3 (25 %). Navíc jsme zjistili, že u různých nádorových onemocnění byly pozorovány velmi dobře ;charakterizované a reprodukovatelné katalytické signály RS2Co, Cat1 a Cat2. Pozorovaná variabilita sledovaných katalytických signálů analyzovaných vzorků kolísala mezi 10 – 20 %. Získané výsledky naznačují na možnost využívat katalytických signálů nejen pro kvantifikaci MT, ale i na souvislost s diagnózou nádorového onemocnění.

Nádorové onemocnění


Obr. 2.
Celkový počet analyzovaných pacientů s nádorovým onemocněním – 72 pacientů (36 mužů a 36 žen). Průměrná hladina metalothioneinu v krevním séru zdravého člověka – 0.6 µM.

Závěr
V našich experimentech bylo ukázáno, že elektroanalytických technik je možné využívat pro studium obsahu metalothioneinu v řadě biologických vzorků [11,21], ale také u pacientů se zhoubnými nádory [15,22].

Poděkování
Příspě vek vznikl za podpory grantů RASO 8/2005 a GAČR 525/04/P132

Literatura

1. Jurickova, L. (2006). Zhoubné nádory v roce 2003. Aktuální informace ústavu zdravotnických informací a statistiky České republiky, 1-4.
   
2. Aschermannova, A. (2005). Úvodník. The Lancet Oncology – Czech 4, 81-81.
   
3. Abrhamova, J. (2005). Národní onkologický registr. http://www.uzis.cz/cz/nor/norindx.htm.
   
4. Kizek, R., Vacek, J., Adam, V., and Vojtesek, B. (2004). Vztah metalothioneinu k rakovine a protinadorove lecbe. Klin. Biochem. Metab. 12, 72-78.
   
5. Zelena, J., Potesil, D., Vacek, J., Adam, V., Hradecky, J., Prusa, R., Kizek, R., and Vojtesek, B. (2004). Metalothionein jako prognosticky marker nadoroveho onemocneni. Klinická onkologie 17, 190-195.
   
6. Petrlova, J., Blastik, O., Adam, V., Mikelova, R., Potesil, D., Trnkova, L., Prusa, R., and Kizek, R. (2005). Detekce zeptomolarnich hladin metalothioneinu chronopotenciometrickou rozpousteci analyzou na rtutove elektrode. In XXIX. Brnenske onkologicke dny (J. Zaloudik and R. Vyzula, eds.). pp. 111-113, Masarykuv onkologicky ustav v Brne: Brno, Ceska republika.
   
7. Prusa, R., Kizek, R., Vacek, J., Trnkova, L., and Zehnalek, J. (2004). Study of relationship between metallothionein and heavy metals by CPSA method. Clin. Chem. 50, A28-A29.
   
8. Prusa, R., Blastik, O., Potesil, D., Trnkova, L., Zehnalek, J., Adam, V., Petrlova, J., Jelen, F., and Kizek, R. (2005). Analytic method for determination of metallothioneins as tumor markers. Clin. Chem. 51, A56-A56.
   
9. Prusa, R., Blastik, O., Kukacka, J., Kizek, R., and Stuchlikova, H. (2005). Plasma metallothionein levels in lead poisoned child. Toxicol. Lett. 158, S156-S157.
   
10. Prusa, R., Blastik, O., Kukacka, J., Zehnalek, J., Adam, V., Petrlova, J., and Kizek, R. (2005). The influence of platinum-based drugs on the amount of metallothionein. Toxicol. Lett. 158, S66-S67.
    
11. Blastik, O., Petrlova, J., Adam, V., Potesil, D., Prusa, R., Stiborova, M., Vojtesek, B., Trnkova, L., Jelen, F., and Kizek, R.
    (2005). Metallothionein – tumour disease marker? In IX. Pracovni setkani biochemiku a molekularnich biologu (M. Wimmerova and P. Benes, eds.). pp. 41-42, Masarykova univerzita v Brne: Brno, Ceska republika.
    
12. Kizek, R. (2006). Jak rychle rozpoznat nador? 21. Stoleti 3, 93-95.
    
13. Kizek, R., Trnkova, L., and Palecek, E. (2001). Determination of metallothionein at the femtomole level by constant current stripping chronopotentiometry. Anal. Chem. 73, 4801-4807.
    
14. Brazdova, M., Kizek, R., Havran, L., and Palecek, E. (2002). Determination of glutathione-S-transferase traces in preparations of p53 C-terminal domain (aa320-393). Bioelectrochemistry 55, 115-118.
    
15. Petrlova, J., Blastik, O., Prusa, R., Kukacka, J., Mikelova, R., Stiborova, M., Vojtesek, B., Adam, V., Zitka, O., Eckschlager, T., and Kizek, R. (2006). Analýza obsahu metatothioneinu u pacientů se zhoubným nádorem prsu, tlustého střeva a nebo melanomem. Klin. Onkol. 19, 58-62.
    
16. Blastik, O., Adam, V., Petrlova, J., Beklova, M., Sures, B., and Kizek, R. (2005). A study of metallothionein content in fish tissues. In MendelNet05 Agro (P. Ryant, R. Cerkal, T. Streda, P. Kapler and K. Vejrazka, eds.), Mendel University of Agriculture and Forestry in Brno: Brno, Czech Republic.
    
17. Petrlova, J., Blastik, O., Prusa, R., Kukacka, J., Potesil, D., Mikelova, R., Adam, V., Zehnalek, J., and Kizek, R. (2005). Using of electrochemical methods for studying of metallothionein content in the human blood serum of a patient poisoned by lead and treated by platinum. Biomedical Papers 149, 485-488.
    
18. Kizek, R., Vacek, J., Trnkova, L., Klejdus, B., and Havel, L. (2004). Application of catalytic reactions on a mercury electrode for electrochemical detection of metallothioneins. Chem. Listy 98, 166-173.
    
19. Petrlova, J., Potesil, D., Mikelova, R., Blastik, O., Adam, V., Trnkova, L., Jelen, F., Prusa, R., Kukacka, J., and Kizek, R.
    (2006). Attomole voltammetric determination of metallothionein. Electrochim. Acta in press.
    
20. Olafson, R.W., and Olsson, P.E. (1991). Electrochemical detection of metallothionein. Methods in Enzymol. 205, 205-213.
    
21. Blastik, O., Petrlova, J., Adam, V., Potesil, D., Benova, V., Prusa, R., Stiborova, M., Vojtesek, B., Trnkova, L., Jelen, F., and Kizek, R. (2005). Interakce metalothioneinu s tezkymi kovy a protinadorovymi lecivy zalozenych na bazi platiny. In XXIX. Brnenske onkologicke dny (J. Zaloudik and R. Vyzula, eds.). pp. 108-110, Masarykuv onkologicky ustav v Brne: Brno, Ceska republika.
    
22. Petrlova, J., Blastik, O., Zitka, O., Adam, V., Potesil, D., Mikelova, R., Prusa, R., Stiborova, M., Trnkova, L., Zehnalek, J., and Kizek, R. (2005). An electrochemical study of metallothionein as a potential tumour disease marker. Annals the Polisch Chemical Society in press.</=ol>