Amplifikace a exprese onkogenu MYCN v chemorezistentních neuroblastomových liniích.

Amplifikace onkogenu MYCN je nejdůležitějším prognostickým znakem u neuroblastomu. Neuroblastom
vysokého rizika (HR NBL) je charakteristický agresivním růstem a velmi nepříznivou prognózou bez ohledu na klinické stádium. Hlavní příčinou selhání chemoterapie je vznik chemorezistence na použité cytostatikum. Proto jsme se zaměřili na rezistenci buněk HR NBL k běžně používaným cytostatikům: doxorubicinu, vinkristinu a cisplatině (CDDP) a látce vykazující protinádorové účinky: BS-RNáze.

Cíle práce:

Komparativní genomovou hybridizací (CGH) vyšetřit HR NBL buněčnou linii UKF-NB-4 a od ní odvozené linie chemorezistentní k výše uvedeným látkám. Zaměřit se na oblast 2p24 s lokalizací genu MYCN a zjištěné změny potvrdit fluorescenční in situ hybridizací (FISH). Metodou RT PCR v reálném čase zjistit expresi mRNA MYCN v senzitivní a chemorezistentních liních. Zkusit kultivovat chemorezistentní linii bez cytostatika a sledovat změny exprese mRNA MYCN v jednotlivých fázích kultivace. Pokusit se přispět k poznatkům o vzniku chemorezistence.

Výsledky:

V oblasti 2p24 jsme metodou CGH prokázali snížení počtu amplifikovaných kopií MYCN u všech chemorezistetních linií oproti linii senzitivní. Tento pravděpodobný úbytek kopií genu MYCN jsme ověřili metodou FISH, kterou stanovujeme přesný počet kopií v každé buňce. To je zajímavé, protože v průběhu léčby se nepopisují významné změny počtu kopií, ale v našem experimentu u chemorezistentních linií se počet kopií snížil. Metodou RT PCR v reálném čase jsme zjišťovali expresi mRNA MYCN. Parentální linie má ve srovnání se vzorkem leukocytů periferní krve zdravého dobrovolníka expresi o více než 2 řády vyšší. Všechny chemorezistentní linie exprimovaly mRNA MYCN o jeden řád více než senzitivní linie. Kultivace UKF-NB-4 CDDP bez CDDP ovlivňuje expresi mRNA MYCN. Exprese se postupně snižuje na úroveň exprese senzitivní linie i když si rezistenci k CDDP zachovává.

Závěry:

Interpretace poklesu počtu kopií genu MYCN a vzestupu jeho exprese zatím zůstává nejasný. Snížení počtu kopií MYCN se může přímo podílet na vzniku chemorezistence. Druhým možným vysvětlením je selekce buněk s nižším počtem kopií MYCN podmíněno zvýšenou citlivostí buněk s vysokou amplifikací MYCN k použitému cytostatiku. Vyšší exprese mRNA MYCN u chemorezistentních linií souvisí s větší malignitou chemorezistetních nádorů popsanou v literatuře. Postupné snižovaní exprese mRNA MYCN v chemorezistentní linii při kultivaci bez cytostatika naznačuje bezprostřední vliv cytostatika na chovaní buněk. Potvrzení významu exprese MYCN je obtížné, protože existují literární údaje o tom, že exprese genu MYCN ovlivňuje apoptózu buněk jinak u neuroblastomu s amplifikací a jinak bez této amplifikace.

Práce vznikla za finanční podpory grantu GAUK 200 079 a MŠMT VZ č. 0021620813.