Analýza obsahu metalothioneinu u pacientů se zhoubnými nádory hlavy a krku.

Klíčová slova
Metalothionein; elektrochemické stanovení; nádory hlavy a krku; nádorový marker

Úvod
Prognóza pacientů s karcinomem hlavy a krku je často špatná, mnohdy i kvůli pozdní diagnostice způsobené špatnou přehledností vyšetřované oblasti a pozdním nástupem symptomatologie ^[1]. Nalezení vhodného markeru, který by umožnil jednoduchou, neinvazivní diagnostiku nádoru a detekci případné recidivy v pooperačně nebo postradiačně změněném terénu, bylo již cílem mnoha prací ^[2-3]. Doposud studované sérové markery, například cyfra 21-1, squamous cell carcinoma antigen, macrophage colony-stimulating factor, matrix-metalloproteinase, tumor-associated antigen, nepřináší zcela přesvědčivé výsledky ^[2]. Recentní výzkumy ukazují na významný vztah hladiny metalothtioneinu (MT) ke karcinogenezi ^[4,5]. MT je intracelulární, nízkomolekulární, na cystein bohatý protein, který je tvořen 61 aminokyselinami ^[6-8]. K primárním rolím MT v organismu patří udržování homeostázy zinku, detoxikace těžkých kovů a ochrana před oxidativním stresem ^[8]. Syntéza MT v játrech je podle experimentálních poznatků indukována při expozici těžkým kovům, infekci, zánětu, po traumatu nebo během onkogeneze. Zvýšená hladina MT byla potvrzena u mnoha histologicky rozličných typů nádorů (prsu, tlustého střeva, ledvin, močového měchýře, plic, ovaria, prostaty, slinné žlázy, nosohltanu, hrtanu) ^[9-12]. Naopak snížená exprese byla popsána u hepatocelulárního karcinomu ^[13]. Sens, Mariamma a Weinlich prokázali u duktálního karcinomu prsu, malobuněčného karcinomu plic a maligního melanomu asociaci overexprese MT s agresivnějším chováním a horší prognózou nádoru. Jeho úloha u nádorů hlavy a krku zatím nebyla zkoumána. Všechny dostupné práce zjišťovaly množství MT přímo ve vzorcích nádorové tkáně. Cílem naší pilotní studie bylo studium obsahu MT v plné krvi u pacientů s karcinomem hlavy a krku.

Materiál a metodika

Klinický materiál
Zkoumaný soubor tvořili pacienti (od konce roku 2005 do poloviny ledna 2006) léčení na Klinice ORL a chirurgie hlavy a krku Fakultní nemocnice U svaté Anny v Brně pro onkologické onemocnění. Zařazeni do souboru byli pacienti s histologicky verifikovanými karcinomemi hlavy a krku lokalizovanými v hltanu, hrtanu nebo dutině ústní. Jejich výsledky byly porovnávány s hodnotami kontrolní skupiny, kterou představovali zdraví dobrovolníci. Elektroanalyticky jsme stanovili hladinu MT v krvi před zahájením léčby.

Příprava vzorků pro elektroanalytické stanovení metalothioneinu
Ze získaných vzorků plné krve bylo odebráno 100 µl a umístěno na 15 min. při 99°C do termobloku (Eppendorf 5430, USA). Poté byly vzorky ochlazeny na 4°C a centrifugovány při 4°C, 15 000 g po dobu 30 min. (Eppendorf 5402, USA). Metalothioneiny patří k termostabilním proteinům, které zůstávají přítomné v roztoku i po jeho tepelné denaturaci. Takto připravené vzorky byly analyzovány námi upraveným postupem adsorptivní přenosové techniky (AdTS) s diferenční pulsní voltametrií (DPV) na přístroji AUTOLAB v klasickém tříelektrodovém uspořádání. AdTS DPV parametry byly následující: čas akumulace 120 s, počáteční potenciál -0,6 V, konečný potenciál -1,6 V, modulační čas 0,057 s, časový interval 0,2 s, potenciálový krok 1,05 mV/s, modulační amplituda 250 mV, Eads = 0 V, teplota 20°C. Množství analyzovaného vzorku bylo 5 µl ^[14].

Výsledky
V souboru onkologických pacientů bylo hodnoceno 17 vzorků. Koncentrace metalothioneinu v plné krvi nabývaly průměrné hodnoty 12,58±4,22 µl/ml. V kontrolním souboru 12 zdravých jedinců byla průměrná koncentrace 8,52±2,90 µl/ml.
Při vzájemném porovnání byly hladiny MT u onkologických pacientů významně vyšší než u kontrolní skupiny (p=0,003). Vyšší koncentraci MT jsme naměřili u pacientů s lokoregionální metastatickou diseminací do krčních uzlin ve srovnání s tumory bez uzlinového postižení. Zatím, pravděpodobně vzhledem k malému počtu pacientů, nebyl tento předpoklad potvrzen na statisticky významné hladině.


Závěr
Pilotní práce sledující hladinu MT u zdravých lidí a u pacientů s nádory hlavy a krku byla zatím provedena na malém souboru. Přesto již získané výsledky ukazují na významnou roli MT u onkologicky nemocných, což bylo statisticky potvrzeno.
Lze očekávat exaktnější výsledky po zpracování většího počtu dat, kdy bude možné i podrobněji ověřit korelaci MT s onkologickými charakteristikami nádorů (histologie, staging, grading) a s parametry přežití (disease free interval, over all survival).
Na tuto pilotní studii navážeme prospektivní studií, ve které budeme monitorovat dynamiku hladiny MT v průběhu léčby (chirurgické, radioterapie a chemoradioterapie).
Očekávaným přínosem by mělo být potvrzení nebo vyvrácení významu MT jako možného markeru u nádorů hlavy a krku.

Poděkování
Příspěvek vznikl za podpory grantů RASO 8/2005 a GAČR 525/04/P132
Literatura

1. Perez, D.E.D., Alves, F.D., Nishimoto, I.N., de Almeida, O.P., and Kowalski, L.P. (2006). Prognostic factors in head and neck adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology 42, 139-146.
   
2. Rodrigo, J.P., Ferlito, A., Suarez, C., Shaha, A.R., Silver, C.E., Devaney, K.O., Bradley, P.J., Bocker, J.M., McLaren, K.M., Grenman, R., and Rinaldo, A. (2005). New molecular diagnostic methods in head and neck cancer. Head and Neck-Journal for the Sciences and Specialties of the Head and Neck 27, 995-1003.
   
3. Agra, I.M.G., Carvalho, A.L., Ulbrich, F.S., de Campos, O.D., Martins, E.P., Magrin, J., and Kowalski, L.P. (2006). Prognostic factors in salvage surgery for recurrent oral and oropharyngeal cancer. Head and Neck-Journal for the Sciences and Specialties of the Head and Neck 28, 107-113.
   
4. Petrlova, J., Blastik, O., Prusa, R., Kukacka, J., Mikelova, R., Stiborova, M., Vojtesek, B., Adam, V., Zitka, O., Eckschlager, T., and Kizek, R. (2006). Analýza obsahu metatothioneinu u pacientů se zhoubným nádorem prsu, tlustého střeva a nebo melanomem. Klin. Onkol. 19, 58-62.
   
5. Prusa, R., Blastik, O., Potesil, D., Trnkova, L., Zehnalek, J., Adam, V., Petrlova, J., Jelen, F., and Kizek, R. (2005). Analytic method for determination of metallothioneins as tumor markers. Clin. Chem. 51, A56-A56.
   
6. Stillman, M.J. (1995). Metallothioneins. Coordination Chemistry Reviews 144, 461-511.
   
7. Dunn, M.A., Blalock, T.L., and Cousins, R.J. (1987). Metallothionein. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 185, 107-119.
   
8. Hamer, D.H. (1986). Metallothionein. Annual Review of Biochemistry 55, 913-951.
   
9. Gallicchio, L.M., Flaws, J.A., Fowler, B.A., and Ioffe, O.B. (2005). Metallothionein expression in invasive and in situ breast carcinomas. Cancer Detection and Prevention 29, 332-337.
   
10. Surowiak, P., Materna, V., Kaplenko, I., Spaczynski, M., Dietel, M., Lage, H., and Zabel, M. (2005). Augmented expression of metallothionein and glutathione S-transferase pi as unfavourable prognostic factors in cisplatin-treated ovarian cancer patients. Virchows Archiv 447, 626-633.
    
11. Florianczyk, B., Osuchowski, J., Kaczmarczyk, R., Staroslawska, E., and Trojanowski, T. (2005). Distribution of metallothioneins in the brain neoplastic cells. Folia Neuropathologica 43, 91-96.
    
12. Dutsch-Wicherek, M., Popiela, T.J., Klimek, M., Rudnicka-Sosin, L., Wicherek, L., Oudinet, J.P., Skladzien, J., and Tomaszewska, R. (2005). Metallothionein stroma reaction in tumor adjacent healthy tissue in head and neck squamous cell carcinoma and breast adenocarcinoma. Neuroendocrinology Letters 26, 567-574.
    
13. Zelena, J., Potesil, D., Vacek, J., Adam, V., Hradecky, J., Prusa, R., Kizek, R., and Vojtesek, B. (2004). Metalothionein jako prognosticky marker nadoroveho onemocneni. Klinická onkologie 17, 190-195.
    
14. Petrlova, J., Potesil, D., Mikelova, R., Blastik, O., Adam, V., Trnkova, L., Jelen, F., Prusa, R., Kukacka, J., and Kizek, R. (2006). Attomole voltammetric determination of metallothionein. Electrochim. Acta in press.
    
15. Becker, J.S., Zoriy, M., Pickhardt, C., Damoc, E., Juhacz, G., Palkovits, M., and Przybylski, M. (2005). Determination of phosphorus-, copper-, and zinc-containing human brain proteins by LA-ICPMS and MALDI-FTICR-MS. Analytical Chemistry 77, 5851-5860.
    
16. Becker, J.S., Zoriy, M.V., Pickhardta, C., and Zillesb, K. (2005). Copper, zinc, phosphorus and sulfur distribution in thin section of rat brain tissues measured by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry: possibility for small-size tumor analysis. Journal of Analytical Atomic Spectrometry 20, 912-917.