Charakteristika tumor infiltrujících lymfocytů u pacientů s metastazujícím melanomem

Cílem této studie bylo charakterizovat a expandovat tumor infiltrující T lymfocyty (TIL), které jsou schopny specificky zničit nádorové buňky u pacientů s metastazujícím melanomem in vitro. Nejprve byla validována expanze lymfocytů periferní krve 5 zdravých dárců a poté 4 pacienti s metastazujícím melanomem. Nejprve byly lymfocyty zdravých dárců stimulovány in vitro nádorovým antigenem (nádorovou myelomovou linií ARH 77 – jednalo se o průkaz expanze nádorově specifických T lymfocytů s cílem simulovat expanzi TIL in vitro). Stimulované aktivované klony T lymfocytů exprimují celou řadu aktivačních markerů, včetně interferonu gama a lze je tudíž separovat imunomagneticky (Miltenyi Biotech). Takto separované aktivované T lymfocyty byly stimulovány vysokými dávkami IL-2 (1000U/ml) 2-3x týdně a jednorázově phytohemaglutininem (10 µg/ml) in vitro za přítomnosti tzv. „feeder cells“, což jsou ozářené alogenní monononukleární buňky jiného zdravého dárce. Kultivace probíhala in vitro po dobu 4 týdnů. Úvodní poč et separovaných T buně k činil 0,56±0,13 x 10⁶ a po 4-týdenní expanzi dosáhl počtu 214,00x10⁶±103,46x10⁶. Expandované T lymfocyty byly zastoupeny po expanzi z 99,5±0,8% a vykazovaly vysokou specifickou cytotoxicitu vůči původní nádorové linii ARH77 (dosud nepublikovaná data).
Na základě těchto úspěšných experimentů, které ukazují možnost rychlé expanze protinádorových T lymfocytů bylo přistoupeno k expanzi TIL u 4 pacientů s metastazujícím melanomem přímo z nádorové tkáně. Ve třech případech se jednalo o lymfatickou uzlinu, postiženou nádorovým procesem a v jednom případě se jednalo o primární ložisko kožního melanomu. Přítomnost nádorových buněk byla prokázána histopatologicky bezprostředně po chirurgickém vyjmutí tkáně. V případě všech tří nádorových uzlin byla expanze TIL zahajována s počtem buněk 5,2x10⁶, 2,9x10⁶, 15,8x10⁶ a po 5-7 týdenní kultivaci došlo k nárůstu na 27,0x10⁹, 56,0x10⁹ a 3,4x10⁹ TIL buněk. Vitalita těchto buněk byla vyšší než 80%. V případě kultivace TIL z primárního ložiska nádoru došlo pouze k minimálnímu nárůstu z 2,2x10⁶ na 12,1x10⁶ TIL po 8-týdenní kultivaci. Z tohoto důvodu je rovněž v protokolu klinické studie navrhováno využívat pouze lymfatických uzlin postižených nádorovým procesem a nikoliv primárních ložisek nádoru, která jsou zpravidla fibrózní a neumožňují požadovanou expanzi TIL. Ve všech 4 případech bylo prováděno vyšetření sterility v průběhu kultivace a bezprostředně před hlubokým zmrazením preparátu TIL. Nedošlo k žádné mikrobiální kontaminaci a rovněž endotoxinový test nepřekročil stanovené limity ani v jednom případě.
Takto získaný preparát expandovaných TIL lze snadno připravit in vitro a je možno jej využít klinicky jako buněčná imunoterapie metastázujícího melanomu.

Tento projekt byl podporován grantem: GAČR č.: 301/04/1387