Charakteristika tumor infiltrujících lymfocytů u pacientů s metastazujícím melanomem

Konference: 2005 XXIX. Brněnské onkologické dny a XIX. Konference pro sestry a laboranty

Kategorie: Maligní melanom a nádory kůže

Téma: Nádorová imunologie a imunoterapie

Číslo abstraktu: 192

Autoři: Prof. MUDr. Jaroslav Michálek, Ph.D.; Andrea Stejskalová; Petra Vidláková; MUDr. Lenka Zahradová, Ph.D.; RNDr. Libor Hanák, PhD.; MUDr. Ivo Kocák, Ph.D.; Mgr. Lucie Říhová (Kovářová), PhD.; prof. MUDr. Jan Žaloudík, CSc.; prof. MUDr. Roman Hájek, CSc.

Cílem této studie bylo charakterizovat a expandovat tumor infiltrující T lymfocyty (TIL), které jsou schopny specificky zničit nádorové buňky u pacientů s metastazujícím melanomem in vitro. Nejprve byla validována expanze lymfocytů periferní krve 5 zdravých dárců a poté 4 pacienti s metastazujícím melanomem. Nejprve byly lymfocyty zdravých dárců stimulovány in vitro nádorovým antigenem (nádorovou myelomovou linií ARH 77 – jednalo se o průkaz expanze nádorově specifických T lymfocytů s cílem simulovat expanzi TIL in vitro). Stimulované aktivované klony T lymfocytů exprimují celou řadu aktivačních markerů, včetně interferonu gama a lze je tudíž separovat imunomagneticky (Miltenyi Biotech). Takto separované aktivované T lymfocyty byly stimulovány vysokými dávkami IL-2 (1000U/ml) 2-3x týdně a jednorázově phytohemaglutininem (10 µg/ml) in vitro za přítomnosti tzv. „feeder cells“, což jsou ozářené alogenní monononukleární buňky jiného zdravého dárce. Kultivace probíhala in vitro po dobu 4 týdnů. Úvodní poč et separovaných T buně k činil 0,56±0,13 x 106 a po 4-týdenní expanzi dosáhl počtu 214,00x106±103,46x106. Expandované T lymfocyty byly zastoupeny po expanzi z 99,5±0,8% a vykazovaly vysokou specifickou cytotoxicitu vůči původní nádorové linii ARH77 (dosud nepublikovaná data).
Na základě těchto úspěšných experimentů, které ukazují možnost rychlé expanze protinádorových T lymfocytů bylo přistoupeno k expanzi TIL u 4 pacientů s metastazujícím melanomem přímo z nádorové tkáně. Ve třech případech se jednalo o lymfatickou uzlinu, postiženou nádorovým procesem a v jednom případě se jednalo o primární ložisko kožního melanomu. Přítomnost nádorových buněk byla prokázána histopatologicky bezprostředně po chirurgickém vyjmutí tkáně. V případě všech tří nádorových uzlin byla expanze TIL zahajována s počtem buněk 5,2x106, 2,9x106, 15,8x106 a po 5-7 týdenní kultivaci došlo k nárůstu na 27,0x109, 56,0x109 a 3,4x109 TIL buněk. Vitalita těchto buněk byla vyšší než 80%. V případě kultivace TIL z primárního ložiska nádoru došlo pouze k minimálnímu nárůstu z 2,2x106 na 12,1x106 TIL po 8-týdenní kultivaci. Z tohoto důvodu je rovněž v protokolu klinické studie navrhováno využívat pouze lymfatických uzlin postižených nádorovým procesem a nikoliv primárních ložisek nádoru, která jsou zpravidla fibrózní a neumožňují požadovanou expanzi TIL. Ve všech 4 případech bylo prováděno vyšetření sterility v průběhu kultivace a bezprostředně před hlubokým zmrazením preparátu TIL. Nedošlo k žádné mikrobiální kontaminaci a rovněž endotoxinový test nepřekročil stanovené limity ani v jednom případě.
Takto získaný preparát expandovaných TIL lze snadno připravit in vitro a je možno jej využít klinicky jako buněčná imunoterapie metastázujícího melanomu.

Tento projekt byl podporován grantem: GAČR č.: 301/04/1387

Datum přednesení příspěvku: 26. 5. 2005