Kvantitativní stanovení nádorových antigenů MAGE A-1 a MAGE A-3 metodou realtime PCR na přístroji LightCycler

Geny MAGE (Melanoma Antigen Gene)rodiny kódují antigenní peptidy, které jsou prezentovány HLA molekulami třídy I a takto rozpoznávány na lidských nádorech autologními cytotoxickými T lymfocyty. Geny MAGE patří mezi tzv. cancer/testis antigeny (CTA), které bývají exprimovány u mnoha typů solidních nádorů, avšak nikoliv ve zdravé tkáni. Jedinou zdravou tkání exprimující tyto antigeny jsou mužské zárodečné buňky (spermatogonie) a placentární trofoblast. Bylo potvrzeno, že MAGE antigeny jsou přísně nádorově specifické, tudíž jsou využívány jako onkologické markery. Protože jsou CTA imunogenní a vyvolávají buněčnou a humorální imunitní odpověď, mohou být rovněž využity při nádorové imunoterapii. Skupina genů MAGE A je tvořena 12 blízce příbuznými homologními členy a je mapována k telomerickému konci dlouhého raménka chromozomu X. MAGE se aktivují v nádorových buňkách následkem demetylace CpG dinukleotidů ve svých promotorech. Exprese MAGE A-1, -2, -3, -4, -6, -10 a -12 byla prokázána u melanomu, karcinomu plic, vaječníků, močového měchýře, žaludku, jícnu, kolorektálního karcinomu, karcinomů hlavy a krku, neuroblastomu, mnohočetného myelomu a dalších malignit. Často bývají koexprimovány s jinými rodinami cancer/testis antigenů, např. BAGE, GAGE, NY-ESO-1/LAGE-1.
V současné době se objevují práce využívající geny MAGE A ke sledování reziduální choroby u pacientů s mnohočetným myelomem (MM). V myelomových buňkách byla prokázána přítomnost RNA transkriptů kódujících některé CTA, nejčastěji MAGE A-1, MAGE A-3 a dále NY-ESO-1 a CT-7/MAGE-C1. Cílem této práce bylo zavedení kvantitativního stanovení nádorových antigenů u pacientů s MM, kteří jsou rovněž prospektivně sledováni po stránce genetické, biochemické a imunologické.
Kvantitativní stanovení nádorových antigenů MAGE A-1 a MAGE A-3 bylo zavedeno pomocí metody Q-PCR v reálném čase na přístroji LightCycler® (Roche Diagnostics, Germany). Toto vyšetření umožňuje vysoce specifickou, dobře reprodukovatelnou a citlivou kvantifikaci mRNA transkriptů v průběhu několika hodin. Z kostní dřeně nebo periferní krve se metodou TRIzol (Invitrogen) izoluje celková RNA, která se následně přepíše do cDNA s použitím Transkriptor reverzní transkriptázy (Roche Diagnostics, Germany). Pro Q-PCR se využívá systému dvojice fluorescenčně značených hybridizačních sond (FRET), které jsou komplementární k vnitřní části amplifikované sekvence. K relativní kvantifikaci se využívá ředící řady externího standardu, kterým je vhodně zvolený referenční gen. Cílová koncentrace je vyjádřena v poměru ke koncentraci referenčního genu měřené ve stejném vzorku.
Optimalizace metody byla provedena na myelomové linii U266, která exprimuje MAGE A-1 a MAGE A-3. Opakovaně bylo prokázáno, že k analýze postačuje 100 myelomových buněk. Tato vysoká citlivost umožní stanovení MAGE antigenů z malého množství dostupného biologického materiálu u pacientů s MM. Metoda byla dosud testována na souboru 15 pacientů s MM. Výsledky kvantitativního stanovení antigenů MAGE u pacientů s různým stadiem MM budou prezentovány.