MŮŽE VÝBĚR MATERIÁLU OVLIVNIT PREDIKTIVNÍ VYŠETŘENÍ METODOU SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE (NGS)?

Konference: 2015 XXXIX. Brněnské onkologické dny a XXIX. Konference pro nelékařské zdravotnické pracovníky

Kategorie: Nádorová biologie/imunologie/genetika a buněčná terapie

Téma: XXX. Základní a aplikovaný výzkum v onkologii

Číslo abstraktu: XXX/ 159

Autoři: Mgr. Jitka Berkovcová, Ph.D.; Mgr. Lenka Radová, Ph.D.; Mgr. Šárka Rathouzská; MUDr. Radim Němeček; prof. MUDr. Marek Svoboda, Ph.D.; MUDr. Pavel Fabián, Ph.D.

Východiska:

 Podmínkou cílené anti-EGFR terapie u pacientů s metastazujícím kolorektálním karcinomem je stanovení mutací genů RAS. Dosud užívané molekulární metody mají kvalitativní charakter. Rozhodující pro volbu metody je její senzitivita a specificita. NGS je vysoce senzitivní, ale zároveň i spe cifické. Dále umožňuje kvantifikaci přítomného markeru v nádoru.

Metody:

Do souboru bylo zařazeno 16 pacientů s operovaným kolorektálním karcinomem v roce 2014. Jako hlavní kritérium byla zvolena velikost nádoru (> 30 mm) nebo pacienti s více nádorovými ložisky. Celkem byla izolována DNA z 38 vzorků s vysokým zastoupením nádorové populace (40–70 %). Příprava DNA knihovny pro platformu MiSeq proběhla pomocí TruSight Tumor kitu (Illumina), který obsahuje „Hot Spots“ 26 vybraných genů (celkem 175 amplikonů). Základní analýza sekvencí byla provedena pomocí softwarů Illumina, dále detekce variant pomocí softwaru Illumina VariantStudio. K následným datovým úpravám byly použity balíky R/ Bioconductor.

Výsledky:

 Námi izolovaná DNA z FFPET dosahuje velice dobré kvality a ze všech vzorků bylo možné připravit DNA knihovny. Q Skore 30 (odpovídá kvalitě sekvencí) bylo dosaženo u více než 96 % sekvencí. Průměrná coverage dosahuje 4 000 čtení. U 7 pacientů jsme detekovali mutaci v genu KRAS v kodonu 12 nebo 13, u tří pacientů V600E mutaci v genu BRAF. Nejčastěji prokázané varianty byly v genu TP53, a to u 12 pacientů. U šesti pacientů molekulární analýza prokázala rozdíly na úrovni subpopulací. U jednoho pacienta, u kterého byla nalezena morfologicky odlišná ložiska primárního tumoru, jsme potvrdili tuto rozdílnost i na molekulární úrovni. Přestože obě ložiska nesou mutace ve stejných genech (KRAS, TP53 a APC), jedná se ve všech třech případech o mutace odlišné, což vypovídá o podobné karcinogenezi obou ložisek.

Závěr:

 Naše výsledky ukazují, že NGS je vhodná pro FFPET vzorky, ale i u této molekulární metody je nutné zdůraznit správnou fi xaci materiálu. Díky paralelnímu vyšetření několika sekvencí vede NGS k úspoře biologického materiálu. Potvrdili jsme stabilní rozložení přítomných mutací genu KRAS napříč nádorovou populací. To odpovídá představě, že pro analýzu klinicky relevantních prediktorů nehraje místo odběru roli. Toto vše z NGS dělá metodu spolehlivou pro prediktivní vyšetření u pacientů s plánovanou cílenou terapií. Vedle toho detekujeme s vysokou senzitivitou i minoritní genové varianty v morfologicky odlišných částích tumoru. Z tohoto pohledu je NGS vhodným nástrojem ke studiu intratumorové heterogenity.

Podpořeno MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805); FP7 grant 306242 NGS-PTL.

Datum přednesení příspěvku: 9. 4. 2015