ODHAD PROGNÓZY PŘEŽITÍ PACIENTŮ S KARCINOMEM SLINIVKY POMOCÍ DETEKCE HYPERMETYLACE A HLADIN MIRNA

Východiska:

Karcinom pankreatu (KP) je onemocnění se závažnou, většinou infaustní prognózou. Průměrná doba přežití od stanovení diagnózy je 3-6 mě­síců a pravděpodobnost pětiletého přežití je méně než 4 %. Terapie spočívá v kombinaci resekčních výkonů a adjuvantní/neoadjuvantní chemoterapie, ale zpravidla nemívá velký efekt. Identifikace biomarkerů predikujících průběh onemocnění může významně ovlivnit léčebné modality, náklady na léčbu a ze­jména pak kvalitu života pacientů. Kromě vyšetřování klasických genetických markerů se dostává do popředí testování epigenetických markerů, zahrnujících hypermetylace DNA, a hladin tzv. mikroRNA (miRNA). Deregulace specifických miRNA stejně jako hypermetylace promotorů tumor supresorových genů byla popsána u řady nádorů včetně KP a ukazuje se, že tyto markery hrají zásadní roli v maligní transformaci buňky. Z literatury je však známo, že na rozdíl od ji­ných typů nádorových tkání je u KP získání dostatečného množství kvalitní tkáně, izolace nukleových kyselin (NK) i samotná analýza miRNA velice obtížná a úspěšnost analýz bývá často nízká. Cílem tohoto projektu byla optimalizace všech dílčích kroků vedoucích k analýze hypermetylace a hladin miRNA a ko­relace výsledků s léčebnou modalitou a délkou přežití.

Materiál a metody:

V rámci endoskopické ultrasonografie byly odebrány vzorky maligní tkáně, ze kterých byla následně provedena izolace NK, a to čtyřmi různými komerčními kity. Kvalita a množství nukleových kyselin pak bylo hodnoceno pomocí gelové elektroforézy a čipového bioanalyzátoru Agilent. Z izolované RNA byla provedena syntéza cDNA dvěma různými komerčními kity a detekce miRNA meto­dou real-time PCR. DNA byla vyšetřena na hypermetylační status u panelu 76 tumor supresorových genů metodou MLPA.

Výsledky:

Způsob odběru vzorku tkáně, výtěžky a kvalita NK, množství získané cDNA a následná úspěšnost analýz hypermetylace a hladin miRNA byla vyhodnocena ve vztahu k použitým po­stupům a kitům na celkem 15 vzorcích KP a byla vybrána jejich optimální kombinace. Ta byla následně aplikována na sadu 10 vzorků z důvodu potvrzení opa­kovatelnosti výsledků. Výsledky analýz u první sady pacientů byly předběžně korelovány s léčebnou modalitou a délkou přežití.

Závěr:

odařilo se optima­lizovat metodiku odběru vzorku, extrakce NK a analýzy hypermetylace a hladin miRNA u pacientů s KP a tento postup úspěšně ověřit na první sadě vzorků. Výsledky ukazují, že klíčovými kroky v celém postupu je prvotní endoskopický odběr vzorku a dále pak izolace NK. Předběžné výsledky analýz ukazují na vý­znamnost obou typů markerů v prognóze onemocnění.

Práce je podpořena grantem IGA MZČR NT13638.