Příprava biologického materiálu pro metodu SELDI TOF MS.

Proteomika se zabývá studiem souboru proteinů, snaží se o jejich identifikaci v kontextu jejich funkce v organizmu za fyziologických a patologických stavů. Technikami tohoto výzkumu jsou především metody založené na separaci molekul v elektrickém poli (jednorozměrná elektroforéza – ELFO, dvojrozměrná elektroforéza – 2D ELFO, isoelektrická fokusace – IEF) a metody založené na stanovování molekulové hmotnosti analytu (hmotnostní spektrometrie – MS a to především MALDI TOF MS* a ESI TOF MS**). Každá z uvedených metod má svou nevýhodu, která brání jejímu použití pro rutinní analýzu proteinů a peptidů. Hlavní nevýhodou 2D elektroforézy je časová náročnost, u IEF je to nedostatečná citlivost, u metod MALDI TOF MS a ESI TOF MS je to náročná přípravu samotného vzorku nebo nemožnost v krátkém časovém úseku zpracovat větší množství vzorků. Tyto nevýhody částečně řeší metoda SELDI TOF MS (Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization – Time of Flight – Mass Spectrometry), která spojuje hmotnostní spektrometrií se separaci proteinů na základě jejich chemických a biochemických vlastností. Stanovované proteiny se na základě svých chemických (náboj, vazba na kov atd.) a fyzikálních vlastností (hydrofilita a hydrofobnost) vážou ze vzorku na „aktivní“ povrch čipu, který je pokryt chemickým (chromatografický povrch: katex, anex, hydrofilní, hydrofobní, navázaný kov – Cu, Ni atd.) nebo biochemickým (navázanou např. protilátkou, receptorem atd.) povrchem. Metoda SELDI TOF MS patří mezi kvalitativní metody. Proteiny specificky navázané na povrch se laserem desorbují z čipu a po ionizaci se dělí na základě poměru své molekulové hmotnosti a náboje (m/z) v hmotnostním spektrometru. Výhodou je zakoncentrování analytu na aktivním povrchu, kdy se stanovované proteiny o nižší koncentraci navážou se na povrch zatímco matrice a nenavázané proteiny jsou vymyty a tím dojde k zakoncentrování. Příprava většího počtu vzorku je relativně snadná a rychlá stejně jako samotná hmotnostní analýza. Mezi hlavní nevýhody patří nutnost odstranit vysocekoncentrované proteiny ze vzorku (např. albumin ze séra) pro zachování dostatečného počtu vazebných míst pro látky s nižší koncentrací; různá afinita proteinů k povrchům čipů a ne příliš dobrá reprodukovatelnost metody. ...

Plný text v pdf