Růstová, genetická a expresní charakteristika neuroblastomové buněčné linie rezistentní k ellipticinu

Úvod

Neuroblastom (NBL) je solidní nádor jehož původem je tkáň sympatického nervového systému. Představuje nejčastější dětský extrakraniální nádor s výskytem v ranném dětství, nejčastěji do čtyř let věku. Řadí se k velmi obtížně léčitelným nádorovým onemocněním. Neuroblastomy jsou charakteristické biologickou variabilitou, s různými genetickými poruchami, maligním potenciálem a různou citlivostí k chemoterapii. Přibližně 40% pacientů s tímto onemocněním trpí neuroblastomem vysokého rizika (high-risk neuroblastoma, HR NBL), charakterizovaným agresivním růstem a velmi nepříznivou prognózou bez ohledu na klinické stádium. I za použití velmi intenzivní terapie a nových léčebných postupů nedošlo v posledním desetiletí k významnému zlepšení v přežívání pacientů s HR NBL. Právě intenzivní chemoterapie za použití cytostatik dle léčebných protokolů je často neúčinná a vede ke vzniku rezistence k použitému léčivu. S tím souvisí snaha o léčení HR NBL novými účinnými léky. Smyslem naší práce bylo zaměřit se na vlastnosti a změny buněk HR NBL vystaveného účinkům ellipticinu, ne zcela běžně používanému cytostatiku. Ellipticin (5,11-dimethyl-6H-pyrido[4,3-b]karbazol) je rostlinný alkaloid, přítomný v listech Ochrosia elliptica. Protinádorová aktivita ellipticinu je popsána a experimentálně i klinicky vyzkoušena. Od 70. let 20. století byly deriváty ellipticinu úspěšně používány ve Francii k léčbě karcinomu prsu s kostními metastázemi, akutní myeloblastické leukémie a karcinomu štítné žlázy. Za zmínku stojí i ellipticinem způsobená inhibice retrovirové integrázy ve viru HIV a jeho zkoumání jako možného léku při léčbě AIDS [1]. Za hlavní cytotoxický a protinádorový účinek ellipticinu a jeho derivátů je považována interkalace do DNA a inhibice topoizomerázy II alfa (TOP2A) [2,3]. Bylo prokázáno, že ellipticin také selektivně inhibuje fosforylaci proteinu p53 v několika lidských nádorových buněčných liniích [4]. Ellipticin rovněž narušuje energetickou rovnováhu buněk odpřahováním oxidativní fosforylace v mitochondriích [5] a zabraňuje proliferaci buněk regulací exprese cyklinu B1 a Cdc2 a fosforylaci Cdc2 [6]. Zajímavá zjištění přinesla studie Haaga a spolupracovníků, kteří popisují ellipticinem zprostředkovanou apoptózu indukovanou stresem endoplasmatického retikula [7]. Velmi důležitým aspektem pozorovaným při léčbě byla individuální variabilita v odpovědi pacientů na podané léčivo. Vysvětlením může být rozdílná individuální výbava enzymy důležitými pro biotransformaci ellipticinu (cytochromy P450, cyklooxygenáza, myeloperoxidáza). Tyto enzymy aktivují léčivo na terapeuticky účinnější derivát, který nádorové buňky poškozuje efektivněji a vede až k jejich zničení [8].

Cílem naší práce bylo zjistit cytotoxický účinek ellipticinu vůči buňkám různých neuroblastomových linií. Dále pak připravit neuroblastomovou linii chemorezistentní k ellipticinu, popsat její vlastnosti, změny v růstu in vitro i in vivo a popsat změny na úrovni exprese genů, transkripce do mRNA a translace do proteinu. Ze zjištěných dat se pokusit odhalit mechanismus vzniku rezistence k ellipticinu, případně identifikovat konkrétní geny, které se podílí na chemorezistenci v souvislosti s léčbou ellipticinem.

Materiál a metody


Chemikálie. Doxorubicin (EBEWE Pharma Ges.m.b.H. Nfg. KG, Unterach, Austria) a ellipticin (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Germany)

Buněčné linie. Lidské neuroblastomové buněčné linie IMR-32, UKF-NB-3 a UKF-NB-4 byly kultivovány v Iscove’s modified Dulbecco’s médiu doplněného 0,3% w/v hydrogenuhličitanem sodným, 4mM L-glutaminem, 10% fetálním hovězím sérem (FBS) a 100 U/ml penicilinem a 100 µg/ml streptomycinem při 37°C, 5% CO2 a 95% vlhkosti vzduchu. Chemorezistentní sublinie UKF-NB-4rDOXO byla kultivována s 100 ng/ml doxorubicinem. Chemorezistentní sublinie UKF-NB-4rELLI byla připravena kultivací v médiu se zvyšující se koncentrací ellipticinu. „Pasážování“ buněk probíhalo většinou v pětidenních intervalech. Počáteční koncentrace ellipticinu, které byly buňky vystaveny byla 1 µM (zásobní roztok 10 mM v DMSO). Finálně je linie kultivována s ellipticinem o koncentraci 2,5 µM.

Viabilita buněk. Byla testována pomocí MTT testu, ve kterém živé buňky metabolizují 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 difenyltetrazolium bromid (MTT) na barevný produkt formazan. Po rozpuštění sraženiny formazanu 20% SDS v 50% dimethylformamidu byla měřena absorbance při vlnové délce 570nm (VERSA max) a vyhodnocena softwarovým programem SOFT max PRO. Hodnoty IC50 linie UKF-NB-4 byla 1,0 µM a linie UKF-NB-4rELLI byla 2,8 µM.

„Colony formation assay“. Pro tvorbu kolonií byly buňky „naředěny“ a „vysety“ po dobu 1-2 týdnů. Kolonie byly fixovány formaldehydem, barveny krystalovou violetí (0,5%) a s použitím mikroskopu počítány.

„In vivo tumorigenicity assay“. „Nunu“ myším kmene CD1 bylo podkožně aplikováno 1x107 buněk lidské neuroblastomové linie UKF-NB-4 nebo UKF-NB-4rELLI s 0,05 ml Matrigelu. Velikost nádorů byla měřena každé 3 dny kaliperem.

Komparativní genomová hybridizace (CGH). DNA izolované ze senzitivní a rezistentní linie (Promega, Madison, USA) byly rozdílně fluorescenčně označeny (Vysis, Downers Grove, IL, USA) a společně hybridizovány na metafázické chromozomy (Vysis, Downers Grove, IL, USA). Po třídenní hybridizaci byly „nasnímány“ mitózy a počítačově vyhodnoceny s použitím softwaru firmy Meta.

Fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Komerčně dostupné sondy (KREATECH Biotechnology B. V., Amsterdam, the Netherlands) byly hybridizovány na interfázická buněčná jádra fixovaná methanolem a kyselinou octovou (3:1).

Expresní microarray: Standardní fenol-chloroformovou extrakcí jsme získali celkovou RNA-, a z ní, pro analýzu na DNA čipech, dsRNA přímo značenou fuorescenčními barvami Cy 3 a Cy 5, podle protokolů v Amino Allyl MessageAmp™ II aRNA Amplification Kit (Ambion Inc.). Provedli jsme dvoubarevně značené hybridizace vzorků vždy proti intaktní kontrole na celogenomové čipy s oligonukleotidovými sondami (29K Rat Array, Microarrays Inc.).

Real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT PCR): Celková RNA byla získána fenol-chloroformovou extrakcí. Koncentrace a kvalita izolovalé RNA byla měřena spektrofotometricky a ověřena na agarosovém gelu. Izolovaná RNA (1 µg) byla převedena na cDNA pomocí náhodných hexamerů (Applied Biosystems, Foster City, CA) a použita pro real-time RT PCR. Vzorky byly analyzovány na ABI 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Western-blot: Proteinové lyzáty z neuroblastomových buněk byly připraveny použitím pufru RIPA. Vzorky obsahující 10-45 µg proteinu byly elektroforeticky rozděleny na 10% SDS polyakrylamidovém gelu a dále přeneseny na nitrocelulózovou membránu (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Inkubace se specifickými primárními protilátkami probíhala 120 minut za míchání při laboratorní teplotě a po promytí blokovacím roztokem (5 x 2 minuty) byla membrána vložena do roztoku sekundární protilátky. Komplex antigenu a protilátky byl vizualizován chemiluminiscenčně (Immun-Star HRP Subststrate, Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Průtoková cytometrie: Proteiny spojené s chemorezistencí P-gp, LRP, MRP1 a MRP2, adhezní molekuly CD56 a CD57 a antiapoptotický protein Bcl2 jsme stanovili cytometricky za použití přímo značených protilátek. Při stanovení Bcl-2 jsme buňky permeabilizovali kitem Fix e Perm.

Výsledky a diskuze

K testování vhodnosti ellipticinu jako možného cytostatika pro léčbu NBL jsme zvolili tři neuroblastomové buněčné linie odvozené od HR NBL: IMR-32, UKF-NB-3 a UKF-NB-4. Všechny testované linie exprimují cytochromy P450, enzymy aktivující ellipticin na účinný derivát. Buněčná linie UKF-NB-4 (linie získaná z relapsu vysoce rizikového neuroblastomu do kostní dřeně) rezistentní k ellipticinu (UKF-NB-4rELLI) vykazovala zvýšenou expresi cytochromů P450 ve srovnání se vzorkem zdravého dobrovolníka. Nicméně, porovnáním exprese cytochromů P450 (CYP3A4, 1B1, 1A1) a COX-1, a -2 v buňkách parentální linie UKF-NB-4 a linie rezistentní k ellipticinu nebyly zjištěny významné rozdíly v expresi cytochromů P450 a COX, ani na úrovni mRNA (expresní mikroarray, real-time RT PCR) ani proteinu (western-blot), z čehož vyplývá, že změny vyvolané rezistencí buněk k ellipticinu neovlivňují expresi těchto enzymů. Uvedené enzymy si stále zachovávají vysoké expresní hladiny, nutné pro aktivaci ellipticinu. Linie UKF-NB-4rELLI má oproti senzitivní linii sníženou tumorigenicitu, a in vivo, v modelovém organismu (nunu myš) roste pomaleji.

Pro poznání genetických změn, které byly indukovány dlouhodobou kultivací buněk UKF-NB-4 s ellipticinem, jsme rezistentní linii (UKF-NB-4rELLI) analyzovali metodou CGH a výsledky porovnali s daty nalezenými v parentální, senzitivní, linii. Změny chromozómových oblastí jsme sledovali metodou FISH, která nám umožňuje, při použití specifické sondy, zjistit přesný počet konkrétních genů a chromozómů. Expresi genů na úrovni mRNA jsme analyzovali metodou „expresní-microarray“ a ověřili metodou RT PCR. V expresi řady genů byly nalezeny změny, které mohou souviset s indukcí chemorezistence. Za nejvýznamnější považujeme snížení exprese genů TOP1 (topoizomeráza 1) a TOP2A, podpořené ztrátou zmnožení genu TOP2A u rezistentní linie. Oblasti chromozómů, kde jsou lokalizovány geny MDR1 (7q21), MRP1 (16p13), LRP1 (12q13-14), bývají u chemorezistentních nádorů zmnožené nebo amplifikované. Linie UKF-NB-4rELLI však žádné takové změny nevykazuje. Ani exprese těchto genů na úrovni mRNA (expresní mikroarray) nebo proteinu (průtoková cytometrie) nebyla u rezistentní linie významně změněna. V případě linie UKF-NB-4 rezistentní k doxorubicinu (UKF-NB-4rDOXO), která má gen MDR1 amplifikovaný, byla průtokovým cytometrem potvrzena vysoká exprese P-glykoproteinu (P-gp). U linie UKF-NB-4rELLI však dochází v expresi Pgp dokonce k poklesu, což odpovídá snížené expresi MDR1 na úrovni mRNA a ztrátě jedné kopie genu MDR1 na úrovni DNA. Ze získaných výsledků vyplývá, že ač jsou některé mechanismy působení doxorubicinu a ellipticinu na nádorové buňky podobné (interkalace DNA, inhibice TOP2A), ellipticin není z buněk transportován prostřednictvím P-gp. Mechanismy chemorezistence jsou tedy u UKF-NB-4rELLI a UKF-NB-4rDOXO rozdílné.

Dalším mechanismem zodpovědným za lékové rezistence může být zvýšená exprese antiapoptotického genu Bcl-2. Rezistentní linie UKF-NB-4rELLI si zachovává zmnožení oblasti 18q21.3, s lokalizací genu Bcl-2, a expresi proteinu Bcl-2 má dokonce zvýšenou. Apoptózu je možné zablokovat i delecí genu BAX. UKF-NB-4rELLI má oblast 19q s lokalizací genu BAX „deletovanou“, na druhou stranu exprese mRNA BAX zůstává beze změn.

Závěry:

Z našich výsledků vyplývá, že ellipticin je nadějným cytostatikem pro léčbu neuroblastomů vysokého rizika. Rezistence k ellipticinu je jev složitý, spojený s mnohočetnými změnami chromozómů a ovlivňující expresi řady genů, které mohou, ale také nemusí, mít vliv na chemorezistenci. Rezistence k ellipticinu neindukuje změny v expresi enzymů esenciálních pro jeho aktivaci. Jedinými změnami, které odpovídají mechanismům vyvolávajícím rezistenci vůči léčivům, jsou snížení exprese TOP1 a TOP2A a zvýšení exprese Bcl-2, podpořené delecí genu BAX.

Literatura:

1. MATHE G, MORETTE C, HALLARD M, PONTIGGIA P, BLANQUET D, HAGE F: Viral and immunologic follow up of 4 to 9 years of AIDS treatments by quadruple combinations of virostatics including integrase inhibitors applied in short sequences differing by drug rotation. Acta Pharmacol Sin 2002, 23:1-15.
2. CHU Y, HSU MT: Ellipticine increases the superhelical density of intracellular SV40 DNA by intercalation. Nucleic Acids Res 1992, 20:4033-4038.
3. FROELICH-AMMON SJ, PATCHAN MW, OSHEROFF N, THOMPSON RB: Topoisomerase II binds to ellipticine in the absence or presence of DNA. Characterization of enzyme-drug interactions by fluorescence spectroscopy. J Biol Chem 1995, 270:14998-15004.
4. OHASHI M, SUGIKAWA E, NAKANISHI N: Inhibition of p53 protein phosphorylation by 9-ydroxyellipticine: a possible anticancer mechanism. Jpn J Cancer Res 1995, 86:819-827.
5. SCHWALLER MA, ALLARD B, LESCOT E, MOREAU F: Protonophoric activity of ellipticine and isomers across the energy-transducing membrane of mitochondria. J Biol Chem 1995, 270:22709-22713.
6. KUO PL, HSU YL, CHANG CH, LIN CC: The mechanism of ellipticine-induced apoptosis and cell cycle arrest in human breast MCF-7 cancer cells. Cancer Lett 2005, 223:293-301.
7. HAGG M, BERNDTSSON M, MANDIC A, ZHOU R, SHOSHAN MC, LINDER S: Induction of endoplasmic eticulum stress by ellipticine plant alkaloids. Mol Cancer Ther 2004, 3:489-497.
8. STIBOROVA M, SEJBAL J, BOŘEK-DOHALSKÁ L, AIMOVÁ D, POLJAKOVÁ J, FORSTEROVÁ K, RUPERTOVÁ M, WIESNER J, HUDEČEK J, WIESSLER M, FREI E: The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res 2004, 64:8374-8380.

Poděkování:

Práce vznikla za finanční podpory MŠMT VZ č. 0021620813, GAUK 7926/2007 a IGA MZ 1A8696-4/2005.