Využití long-oligonucleotide arrayCGH v diagnostice leukémií.

Konference: 2006 XXX. Brněnské onkologické dny a XX. Konference pro sestry a laboranty

Kategorie: Onkologická diagnostika

Téma: Analýza nádorového genomu a proteomu

Číslo abstraktu: 197p

Autoři: Ing. Petra Kozubíková; MvDr. Boris Tichý, Ph.D.; Dita Mentzlová; prof. MUDr. Jiří Mayer, CSc.; Ing. Dana Dvořáková, CSc.; prof. RNDr. Šárka Pospíšilová, Ph.D.

Většina nádorů je provázena abnormalitami genomu nádorových buněk jako jsou delece a amplifikace úseků DNA, případně přestavby chromozomů. Některé z těchto změn jsou specifické pro určité typy nádorů a jsou jednou z příčin vzniku onemocnění, jiné vznikají až sekundárně v důsledku neregulované proliferace buněk, u kterých selhaly opravné mechanismy. Znalost těchto aberací má velký význam pro určení prognózy i výběr odpovídajícího terapeutického plánu a jejich detekce se proto stala nedílnou součástí diagnostických schémat onkologických onemocnění.
CGH (komparativní genomová hybridizace) je založena na současné hybridizaci dvou fluorescenčně značených vzorků genomové DNA (referenčního a vyšetřovaného) na metafázní chromozomy. Delece či amplifikace se pak projeví jako snížení resp. zvýšení intenzity signálu vyšetřovaného vzorku v určité oblasti chromozomu. Kompletní znalost sekvence lidského genomu otevřela cestu novému přístupu – arrayCGH (CGH čipy). U CGH čipů jsou jako sondy používany reprezentativní úseky chromozomů se známou pozicí imobilizované na pevném nosiči, stejně jako u expresních DNA čipů. Pro přípravu CGH čipů existuje více přístupů. Tyto se liší typem použitých sond: velké inzerty genomických klonů jako jsou bakteriální arteficiální chromozomy
(BAC) nebo méně komplexní nukleové kyseliny, jako jsou cDNA, produkty PCR reakce a oligonukleotidy. Nejperspektivnější technikou jsou arrayCGH připravované in-situ syntézou oligonukleotidů, které nabízejí současně vysoké rozlišení a flexibilitu. Návrh čipu lze přizpůsobit požadované aplikaci – pro screening lze použít sondy rovnoměrně pokrývající celý genom, pro konkrétní diagnostické nebo výzkumné potřeby lze zvýšit počet specifických oligonukleotidů pro určité úseky genomu a tím zvýšit rozlišení čipu pro požadovanou oblast.
Pomocí CGH čipů jsme vyšetřili vzorky pacientů s chronickou lymfatickou leukemií (CLL), u kterých byla dříve provedena cytogenetická analýza. Aberace zjištěné v našem souboru pacientů zahrnovaly např. trizomii chromozomu 12, deleci 13q14 nebo 17p13.1. K vyšetření jsme použili Human Genome CGH Microarray 44B obsahující asi 40.000 oligonukleotidů o délce 60 bazí navržených pro rovnoměrné pokrytí celého genomu. Průměrná vzdálenost mezi jednotlivými sondami v genomu je přibližně 35 kb. Většina sond je navržena do kódujících oblastí genomu, menší část hybridizuje s intergenovými úseky DNA. Sondy jsou syntetizovány in-situ na čipu metodou „SurePrint technology“, která využívá k depozici nukleotidů „ink-jet“ metodu. Výsledky analýzy CGH čipů nejenže potvrdily cytogenetická data, ale zároveň odhalily další aberace genomu, které nebyly při vyšetření FISH zaměřeném na soubor aberací standardizovaný pro danou diagnózu odhaleny, např. delece 18q nebo delece chromozomu X u jednoho z pacientů.
Dokázali jsme, že arrayCGH jsou vhodným rozšířením současných cytogenetických postupů, především jako metoda screeningu genomových aberací s velmi dobrou schopností jejich lokalizace. Lze očekávat, že CGH čipy najdou velmi rychle uplatnění nejen v lékařském výzkumu, ale i onkologické nebo prenatální diagnostice.

Práce byla podporována grantem IGA MZ ČR NR 8448-3/2005

Datum přednesení příspěvku: 11. 5. 2006