Využití molekulárně cytogenetických metod u mozkových nádorů dětského věku.

Na vzniku nádorů se významně podílí změny chromozomů a genů. Řada chromozomálních aberací a genových mutací postihujících nádorovou buňku je specifická pro určité nádory nebo jejich varianty. Jejich průkaz se proto využívá v diagnostice a klasifikaci některých nádorů. V současnosti je již postupem non legee artis, pokud není provedeno cytogenetické a/nebo molekulárně genetické vyšetření nádorových buněk leukemií a lymfomů a jejich význam stoupá i u pacientů se solidními nádory. Průkaz specifických aberací je v současné době již součástí rutinní diagnostiky u řady zhoubných nádorů. Nejznámějším příkladem je stanovení amplifikace genu erb-B2 u karcinomu prsu nebo amplifikace genu MYCN u neuroblastomu. Do budoucna lze předpokládat, že se zaváděním nových léčebných postupů (genová terapie, směrované léky, inhibitory signálního přenosu, onkolytické viry aj.) výrazně vzroste význam cytogenetického, a zvláště molekulárně genetického vyšetření, které umožní vybrat pacienty vhodné k příslušné terapii.
K vyšetření chromozomálních aberací lze použít několik metod. Jejich použitelnost uvádí tabulka č . 1. Vyšetření karyotypu umožňuje prokázat numerické a hrubší strukturální aberace chromozomů na základě jejich morfologické změny v mitóze. Hlavní výhoda tohoto vyšetření je v tom, že na rozdíl od většiny ostatních metod detekuje změny na všech chromozomech při jednom vyšetření současně. Nedostatky jsou menší citlivost a relativně častá neúspěšnost. I renomovaná pracoviště dosahují pouze 40– 60% úspěšnosti klasického cytogenetického vyšetření solidních nádorů (u akutních leukemií je úspěšnost vyšší). Podmínkou úspěšného cytogenetického vyšetření jsou dělící se nádorové buňky. Získat potřebné množství mitóz je obtížné. Problémem je i to, že získané mitózy nemusí pocházet z nádorových buněk. Proto se nález normálního karyotypu musí hodnotit obezřetně. I v době molekulárně genetických metod zůstává cytogenetické vyšetření základní metodou průkazu chromozomálních změn.
Fluorescenční in situ hybridizace (FISH), její modifikace multicolor FISH a sky jsou založeny na hybridizaci DNA sondy značené fluorochromem ke komplementárnímu úseku DNA ve fixovaných buňkách a její detekci fluorescenčním mikroskopem.
Sondy jsou různého typu: 1) centromerické – hybridizují s repetitivními sekvencemi centromerických oblastí a jsou vhodné ke zjišťování počtu kopií příslušného chromozomu; 2) hybridizující se specifickými sekvencemi – detekují amplifikace nebo delece určitých chromozomálních oblastí, kombinaci dvou různě značených sond lze využít k diagnostice translokací;3) malovací (painting), což je řada sond hybridizujících vedle sebe po celé délce jednoho chromozomu tyto sondy se, na rozdíl od předchozích, které lze využít na interfazická jádra i na mitózy, aplikují pouze na mitózy. Umožňují zjistit numerické i strukturální změny konkrétního chromozomu. V kombinaci jsou malovací sondy vhodné k hodnocení translokací. Hlavním využitím FISH je průkaz numerických odchylek chromozomů nebo jejich částí, detekce amplifikací nebo delecí a při použití dvou sond i translokací. Výhodou interfazické FISH je vyšetření i v situaci, kdy nelze získat mitózy. Oproti většině molekulárně biologických metod, které pracují s izolovanou DNA nebo RNA, vyšetří FISH jednotlivá jádra nádorových buněk samostatně. Zavedení nových fluorochromů umožnilo mnohobarevnou FISH (mFISH), která hodnotí více chromozomů najednou – to je zvláště vhodné pro posuzování komplexních translokací. Jako poslední byla vyvinuta SKY (spectral karyotyping), která barevně identifikuje všechny lidské chromozomy současně. Podstatou je použití dvaceti čtyř malovacích sond proti všem chromozomům. Jinou modifikací FISH je srovnávací genomová hybridizace (CGH, comparative genomic hybridization). Normální = kontrolní a vyšetřovaná DNA jsou každá označena jiným fluorochromem (kontrolní červeně a nádorová zeleně) a jsou současně hybridizovány na normální lidské chromozomy v metafázi. Fluorescence se snímá kamerou a vyhodnocuje počítačem. Poměr intenzit fluorescencí podél jednotlivých chromozomů určí místa s chyběním nebo nadbytkem DNA. Tato metoda je ideální ke zjišťování ztráty nebo zmnožení chromozomů či jejich částí, nelze jí využít k detekci balancovaných translokací. Výhodou je, že k vyšetření nejsou nutné dělící se buňky.
Detekce typické chromozomální aberace má význam pro potvrzení diagnózy. V praxi se jejich cytogenetický nebo molekulární průkaz využívá hlavně u atypických případů. Sami jsme verifikovali diagnózu PNETu ledviny průkazem pro tuto skupinu nádorů specifické translokace t(11;22). Postižení ledviny tímto typem nádoru je velmi vzácné, jeho chování je agresivnější, než v jiných lokalizacích a v literatuře bylo dosud popsáno jen několik desítek případů. U jiného pacienta jsme upřesnili diagnózu nádoru mediastina. Histologické vyšetření prokázalo rabdomyosarkom. Ovšem zvýšené hladiny AFP a odpověď na terapii používanou k léčbě germinálních nádorů svědčily pro germinální původ nádoru. Průkaz zmnožení materiálu krátkého raménka 12. chromozomu metodou CGH v naší laboratoři nakonec potvrdil diagnózu germinální nádoru s transformací do rabdomyosarkomu (germinální složky nebyly v histologickém vzorku zachyceny).
Prognóza některých nádorů je spojena s přítomností specifických chromozomálních aberací. Zpřesnění prognózy umožňuje adresnou terapii – u pacientů s lepší prognózou se užívá méně intenzivní léčba s omezenými komplikacemi, ale zachovanou účinností. Naproti tomu u nejrizikovějších pacientů jsou indikované velmi intenzivní postupy. Jako příklad může posloužit velmi špatná prognóza dětí nemocných neuroblastomem s amplifikací genu MYCN.
V současné době se zavádí terapie, cílená proti specifickým buněčným molekulám. Nejznámější je inhibitor specifické bcr/abl tyrozinkinázy, imatinib mesylát (Glivec), který potlačuje proliferaci buněk s fúzním genem bcr/abl. Produkt genu erb-B2 je exprimován nádory s amplifikací tohoto genu (karcinom prsu, ovaria a kolorekta). Nádory s touto amplifikací špatně reagují na obvyklou chemoterapii, ale je u nich popisovaná příznivá odpověď na vysoké dávky antracyklinů. Jinou léčebnou možností u těchto nádorů je trastuzumab. Průkaz uvedených aberací tedy umožní vyhledat pacienty, u kterých je příslušná terapie indikovaná. Při zavádění nových léčebných postupů (genová terapie, specifické inhibitory) budou specifická, molekulárně biologická vyšetření nedílnou součástí výběru léčebného postupu a bez nich nebude možné tuto léčbu indikovat.
Mozkové nádory jsou nejčastějšími solidními nádory dětí. Přesto je málo známo o prognostických molekulárně biologických znacích – v současnosti je v praxi využíváno pouze vyšetření MYCC u meduloblastomu, kdy je jeho amplifikace známkou horší prognozy. My jsme se zaměřili na sledování amplifikace MYCN a MYCC u jednotlivých mozkových nádorů pomocí FISH, DNA ploidie metodou průtokové cytometrie a u vybraných nádorů vyšetření CGH.
Výskyt amplifikace MYCC a MYCN u jednotlivých nádorů ukazuje tabulka 2. DNA aneuploidní byly podstatně častěji gliální nádory vysokého stupně malignity než low grade gliomy. Rovněž pomocí CGH neprokazujeme u nízce maligních gliomů žádné chromozomální aberace. Metodou CGH a CGH microarray jsme prokázali u supratentoriálního PNETU dosud nepopsanou amplifikaci MYCN a NCOA3(AIB1).
Tato vyšetření mohou přispět při určení gradu některých mozkových nádorů dětského věku.


Tabulka 1. Detekce chromosomálních aberací cytogenetickými metodami.
– metodu nelze použít, ± metodu lze využít s omezením, + metoda je vhodná k detekci,
*lze pouze prokázat morfologický podklad double minutes nebo homogenně se barvící úseky (HSR), ale nelze zjistit který gen nebo chromozomální oblast je amplifikována


Tabulka 2.
Výskyt amplifikace (poměr počet kopií sledovaného genu a centromer příslušného chromozomu je 4 nebo více)
a zmnožení (poměr počet kopií sledovaného genu a centromer příslušného chromozomu je větší než 1 ale menší než 4) MYCC a MYCN u mozkových nádorů. Kromě počtu pacientů v jednotlivých skupinách jsou údaje v procentech.

Práce vznikla za finanč ní podpory VZ MSM 0021620813 a VZ MZO 00064203