Diagnostika genetických změn u papilárního karcinomu štítné žlázy

Úvod: Papilární karcinom (PTC) je nejběžnější malignitou štítné žlázy (80–85 %). Nejčastější příčinou je aktivace proto-onkogenů RET a BRAF. RET onkogen je aktivován RET/PTC přeskupením (rearrangements), které vzniká fúzí intracelulární tyrozinkinázové domény RET genu a jiného konstitutivně exprimovaného genu. Výskyt RET/PTC přeskupení je velmi variabilní (5–70%) v závislosti na geografických faktorech a použité metodice. K velkému nárůstu PTC došlo po černobylské havárii (26. duben 1986). RET/PTC je spojován s agresivnější formou PTC a častou tvorbou vzdálených metastáz. V současné době je známo několik fúzních forem, které vznikají inverzí nebo translokací. Nejčastější jsou RET/PTC1 a RET/PTC3 přeskupení. BRAF gen kóduje cytoplasmatickou serin/threoninovou proteinkinázu patřící mezi RAF proteiny. K aktivaci dochází substitucí T → A na pozici 1799 v 15. exonu způsobující substituci valinu za glutamát v kodonu 600 (V600E). Tato mutace je nejčastější genetickou změnou u PTC (29–69 %) a koreluje s vyšším stupněm TNM klasifikace, agresivnější formou nádoru a s horší prognózou onemocnění.
Cíl: Detekce BRAF V600E mutace a RET/PTC přeskupení u PTC pacientů v české populaci.
Materiál a metody: Soubor tvořilo 44 odoperovaných čerstvých tkání PTC pacientů, 9 biopsií tenkou jehlou z PTC tkání a 92 parafinových bločků. DNA a RNA z čerstvých tkání a biopsií jsme izolovali pomocí Trizolové metody. Expresi RET/PTC přeskupení jsme detekovali v cDNA čerstvých tkání, která byla převedena z RNA pomocí reverzní transkripce. Kvalita a přítomnost cDNA byla ověřena pomocí exprese ubikvitárního genu GAPDH a specifického genu pro štítnou žlázu PAX8. DNA z parafinových bločků jsme získali pomocí QIAamp DNA Blood Mini Kitu. Mutaci V600E jsme detekovali screeningovou metodou SSCP (single strand conformation polymorphism) a pozitivní vzorky ověřili přímou fluorescenční sekvenací. Pro zjištění vlivu černobylské havárie na výskyt této mutace v České republice jsme vzorky rozdělili do pěti období – jedno období před černobylskou havárií a čtyři období od roku 1986 do současnosti.
Výsledky: Expresi RET/PTC1 jsme nalezli u 2 pacientů (4,2%), RET/PTC3 u 1 pacienta (2,1 %) a neurčené fúzní formy RET/PTCX u 2 pacientů s PTC (4,2%). Mutaci V600E v BRAF genu jsme detekovali u 56 pacientů s PTC (38,6%). Jeden pacient byl homozygotem, ostatní heterozygoty. V období před rokem 1986 (10 pacientů) jsme nedetekovali žádnou BRAF mutaci, v následujících obdobích jsme mutaci detekovali u 56 pacientů (41,2%). Zdá se, že tato mutace nekoreluje s věkem diagnózy. Soubor tvořilo 21,4 % mužů a 78,6% žen, z toho 48,4 % mužů a 36 % žen mělo BRAF mutaci.
Závěr: RET/PTC přeskupení jsme detekovali u 5 ze 48 pacientů (10,4%), mutaci V600E jsme zachytili u 38,6 % ze 145 pacientů. Výskyt mutace V600E je vyšší u mužů. Zdá se, že se jedná o majoritní genetickou změnu, která hraje důležitou roli v patogenezi PTC. Toho by se mohlo využít v klinické praxi pro potvrzení diagnózy případně pro určení diagnózy z biopsie tenkou jehlou ještě před operací pacienta.
Tato práce je podpořena grantem IGA MZ ČR NR/7806-3.